研究背景：随着心血管疾病发病率的日益增多，对其发病机制以及治疗方面的研究已经成为国内外医学界研究的重点。心力衰竭是指在保持机体一定回心血量的情况下，心脏的收缩和（或）舒张功能下降以致绝对或相对不能满足机体代谢需要的病理生理过程。儿科心力衰竭常见于先天性心脏病、心肌炎、心肌病或者严重呼吸道疾病的小儿。存在于正常心肌细胞内的各种钙稳态相关蛋白已经被广泛认为在导致和促使心功能不全，电生理不稳以及心律失常等事件中扮演着主要角色。生物学功能多样的钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca²⁺/Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，作为心肌钙循环中重要的调控蛋白，其下游存在着丰富的靶位点并在心肌兴奋-收缩偶联（Excitation contraction coupling，ECC）过程中起着重要的支持作用。心肌细胞通过提高细胞内钙离子浓度激活CaMKⅡ。而当心脏负荷过重时，CaMKⅡ可过量激活，通过影响部分钙循环过程促进心脏衰竭和心律紊乱的发生发展。一般情况下，CaMKⅡ通过磷酸化作用介导L型钙通道（L-typecalcium channel，LTCC）和兰尼碱受体（Ryanodine receptor，RyR）的激活来调控ECC的正常过程。ECC初期，钙流通过激活的LTCC进入心肌细胞，产生心肌去极化。这部分通过LTCC进入心肌细胞内的少量钙流进一步激活心肌肌浆网（Sarcoplasmic reticulum，SR）上RyR受体，使其释放大量钙离子，这就是经典的“钙触发钙释放”。通过心肌细胞内SR释放的足够浓度的钙离子是实现心肌细胞收缩和其他重要功能的关键。而在心脏舒张期开始时，受磷蛋白（Phospholamban，PLN）发挥负性调节作用，解除对心肌SR上Ca²⁺-ATP酶(Sarcoplasmicreticulum Ca²⁺-ATPase，SERCA)的抑制，通过SERCA回收心肌细胞中的钙离子。在心血管疾病中，如果CaMKⅡ过表达，可通过使LTCC、RyR和SERCA/PLN过磷酸化影响ECC过程，进而使心功能受损。既往研究中发现成年心功能不全动物中CaMKⅡ的表达增多，并与结构性心脏病和心肌电生理紊乱有关，但针对幼年动物的心功能不全以及与CaMKⅡ的关系的研究尚处于空白。近年来有研究发现CaMKⅡ除了磷酸化激活位点，尚可能存在活性氧（Reactive oxygenspecies，ROS）介导的氧化激活位点。故本课题组基于对心功能不全幼鼠模型的构建，研究缬沙坦对心功能不全幼鼠的治疗效果以及相关的CaMKⅡ表达，并尝试进一步探讨CaMKⅡ可能的磷酸化和氧化激活过程。本研究主要分为以下三个部分：第一部分幼鼠腹主动脉部分缩窄的心功能不全模型的建立和评价目的：构建心功能不全幼鼠模型。方法：通过腹主动脉缩窄术（Abdominal aortic constriction，AAC）构建3周龄SD雄性幼鼠心功能不全模型（n=28），缩窄直接约0.06mm。同期构建仅分离腹主动脉的假手术组幼鼠模型（n=8）。术后4周采用高频超声心动图检测各组大鼠左室收缩和舒张末期内径（Leftventricular-internal dimension systole，LVIDs；Left ventricular-internaldiastolic diameter，LVIDd），左室收缩和舒张末期容积（Left ventricularend-systolic volume，LVESV；Left ventricular end diastolic volume，LVEDV），左室射血分数（Left ventricular ejection fraction，LVEF），左室短轴收缩率（Left ventricular fractional shortening，LVFS）。结果：共28只幼鼠行AAC，其中有10只幼鼠在术中或术后1周死亡，AAC手术存活率约73.68%，假手术组无幼鼠死亡。经过高频超声心动图检测，与正常幼鼠相比，行AAC后4周的SD幼鼠LVIDs、LVESV升高（t=2.016，P=0.002；t=1.769，P=0.029），LVEF、LVFS降低（t=4.22，P<0.001；t=5.339，P<0.001），LVIDd、LVEDV差异无统计学意义（P>0.05）。结论：成功构建的心功能不全幼鼠模型，具有一定的术后存活率，并且心功能下降，以收缩功能降低为主。为进一步研究缬沙坦对幼鼠的治疗效果和对CaMKⅡ的影响提供了病理模型。第二部分缬沙坦对压力负荷增高性心功能不全幼鼠心功能和心肌重构的影响目的：研究缬沙坦对幼鼠心功能不全的治疗效果。方法：术后1月，将心功能不全的18只幼鼠随机分为心衰组（n=10）和治疗组（n=8）。通过灌胃给予治疗组幼鼠缬沙坦30mg/（kg·d）治疗4周，同时心衰组和假手术幼鼠给予安慰剂。各组幼鼠到达实验终点时，采取高频经胸超声检测各组幼鼠LVIDs、LVIDd、LVESV、LVEDV、LVEF、LVFS，分别计算左、右心室重量指数（Left ventricularmass index，LVMI； Right ventricular mass index， RVMI），苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色和Masson胶原染色观察不同组幼鼠间心肌纤维形态和胶原增生情况。结果：经过缬沙坦治疗4周后，与假手术组（n=8）比较，心衰组（n=10）LVIDs、LVESV均明显升高（F=21.082,P <0.001；F=14.178，P=0.001）, LVEF、LVFS均明显降低（F=103.766，P <0.001；F=62.953，P <0.001），LVMI明显增加（F=13.272，P=0.01），LVIDd、LVEDV和RVMI无明显统计学差异（P>0.05）。缬沙坦组与假手术组相比，心功能以及心室重量指数无统计学差异（P>0.05）。与假手术组和治疗组相比，HE染色显示心衰组心肌纤维增粗，直径明显增大（F=126.66，P<0.001；P <0.001），紊乱，甚至发生心肌断裂，Masson胶原染色显示心衰组胶原纤维增生。而经过缬沙坦治疗，治疗组和假手术心肌纤维增粗和胶原增生情况无明显差异（P>0.05）。结论：与心衰组相比，治疗组心功能不全情况得到极大改善，心室重量指数减小，心肌重构较轻，显示缬沙坦在治疗幼鼠心衰方面有明显疗效。此部分研究为进一步探讨心功能不全时CaMKⅡ的表达以及缬沙坦在心衰治疗中的可能机制奠定了基础。第三部分缬沙坦对心功能不全幼鼠心肌细胞内CaMKⅡ及其亚型表达和激活的干预研究目的：研究缬沙坦治疗后心功能不全幼鼠心肌细胞内CaMKⅡ、CaMKⅡ亚型及其磷酸化，氧化激活位点的表达情况，探讨缬沙坦通过局部调节CaMKⅡ的表达治疗幼鼠心功能不全可能的机制。方法：利用Western blot技术检测各组幼鼠心肌细胞内CaMKⅡ的表达，以及相关磷酸化位点（Thr286）和氧化位点（Met281）的激活。结果：与假手术相比，心衰组心室肌细胞内CaMKⅡ表达升高1.95倍（F=7.541，P=0.026），CaMKⅡ亚型（δB+δ9）表达升高1.93倍（F=7.042，P=0.029），CaMKⅡδC表达升高1.93倍（F=6.714，P=0.045），CaMKⅡγ表达量极低在组间未见明显差异（P>0.05）；Thr286-CaMKⅡ表达升高6.15倍（F=16.388，P <0.001），Met81-CaMKⅡ表达稍升高但无统计学差异（P>0.05）。经缬沙坦治疗后，治疗组与假手术组比较，CaMKⅡ、CaMKⅡ亚型以及相关活化位点的表达没有显著差异（P>0.05）。结论：心衰时CaMKⅡ被激活呈过表达，缬沙坦改善幼鼠心功能可能与其下调CaMKⅡ的过表达有关，其中亚型（δB+δ9），δC的过表达在心功能不足的早期起着重要作用，而CaMKⅡγ表达量低，组间未发现明显差异，其在心衰发展后期是否有所改变需要通过进一步的实验研究来探讨。关于CaMKⅡ的激活方式，在本实验中认为相对于氧化位点Met281，磷酸化位点Thr286的活化可能是CaMKⅡ早期激活的主要方式。