骨骼肌和脂肪组织在动物生长发育中占有重要地位,是葡萄糖和脂肪酸利用的主要场所,对机体脂质代谢和葡萄糖稳态具有重要调控作用。胎儿期和新生期是骨骼肌和脂肪组织发育的关键时期,关系到成年动物的胴体品质和代谢健康。研究表明,能量作为母体妊娠期和泌乳期最关键的营养因素,对后代的生长发育起着重要的作用。然而,妊娠期母体能量水平对胎儿及生后肌肉和脂肪发育的影响及其机制尚不完全清楚。研究发现,白藜芦醇(Resveratrol,RES)作为一种普遍存在于水果和植物中的自然多酚类化合物,可促进骨骼肌纤维发育并且抑制白色脂肪细胞分化。但是,目前关于母体摄入RES影响子代骨骼肌和脂肪组织生长发育的研究还未见报道。因此,本研究旨在考察母体能量水平对胎儿骨骼肌纤维发育的影响,探讨母体高能饲粮添加RES对出生后子代肌肉和脂肪组织生长发育的调控作用,以揭示母体营养与子代机体代谢健康的关系及这一过程中RES的作用机制。本研究共包括以下三个试验:试验一品种和能量摄入水平对猪胎儿骨骼肌纤维发育的影响本试验旨在考察不同发育时间点猪胎儿骨骼肌纤维发育的品种差异,并进一步探讨母体能量水平对不同品种猪胎儿骨骼肌生长发育和代谢功能的影响。试验选取体重相近的纯种初产大白母猪(135.54 ±0.66 kg)和梅山母猪(72.84 ±0.66 kg)各36头。配种成功后,大白猪按体重和背膘厚随机分为高能组(HE;妊娠1-35天为5.36McalNE/天,妊娠36-90天为6.43 Mcal NE/天)和对照组(CON,参照NRC 2012推荐妊娠母猪能量需要;妊娠1-35天为4.65 Mcal NE/天,妊娠36-90天为5.58 Mcal NE/天),每组18头母猪。梅山猪按体重和背膘厚随机分为高能组(CON,参照NRC 2012推荐妊娠母猪能量需要;妊娠1-35天为4.65McalNE/天,妊娠36-90天为5.58McalNE/天)和低能组(LE,参照中国地方猪饲养标准—妊娠母猪营养需要;妊娠1-35天为3.96McalNE/天,36-90天为4.75 Mcal NE/天),每组18头母猪。在妊娠35天、55天和90天时,各处理组分别选取4头母猪麻醉屠宰,每头母猪收集4个胚胎和胎儿背最长肌样品,同时采集妊娠55天和90天胎儿脐带血,收集血清样品。试验结果如下:(1)在相同能量水平下,与梅山猪相比,大白猪妊娠35天胚胎和妊娠90天胎儿背最长肌中配对盒基因7(Pax7)、肌细胞生成素(Myogenin)、生肌因子5(Myf5)、生肌调节因子4(MRF4)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)和胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)mRNA的表达显著提高(P<0.05);妊娠35天胚胎背最长肌中过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARy)、胚胎型肌球蛋白重链(MyHC-embryonic)、胎儿型MyHC(MyHC-perinatal、Ⅰ 型 MyHC(MyHC-I)Ⅱa 型 MyHC(MyHC-Ⅱa)Ⅱx 型MyHC(MyH-Ⅱx)和Ⅱb型 MyHC(MyHC-Ⅱb)mRNA 的表达极显著提高(P<0.01);妊娠55天胎儿生肌分化因子1(MyoD)、Myogenin、肌结蛋白(Desmin)、肌肉肌酸激酶(CKM)、生长激素受体(GHR)、IGF-1、IGF-1R、PPARγ和MyHC-perinatal mRNA 的表达显著降低(P<0.05),而MyHC-Ⅱa MyHC-Ⅱb mRNA 的表达显著提高(P<0.05);妊娠90天胎儿体重、背最长肌中脂肪酸结合蛋白4(aP2)、MyHC-embryonic、MyHC-perinatal、沉默信息因子 1(Sirt1)、核呼吸因子 1(NRF-1)和线粒体转录因子A(Tfam)mRNA的表达显著提高(P<0.05),而脐带血清T3含量、背最长肌中乳酸脱氢酶(LDH)活性、异柠檬酸脱氢酶(ICDH)活性和NAD+和NADH浓度极显著降低(P<0.01)。(2)与CON组相比,HE组妊娠55天和90天大白母猪体增重显著增加(P<0.05),大白猪妊娠35天胚胎及妊娠55天和90天胎儿体重无显著差异(P>0.05);与CON组相比,HE组大白猪妊娠35天胚胎背最长肌中MyHC-embryonic、MyHC-perinatal、MyHC-Ⅰ和MyHC-ⅡamRNA的表达显著降低(P<0.05),而妊娠55天胎儿MyHC各亚型基因的mRNA表达没有显著差异(P>0.05);妊娠55天和90天胎儿背最长肌中蛋白含量和肌酸激酶(CK)活性显著降低(P<0.05);妊娠35天胚胎和妊娠 90 天胎儿背最长肌中 Pax7、MyoD1、Myogenin、Myogenin、MRF4、CKM、IGF-1 和胰岛素样生长因子连接蛋白5(IGFBP5)mRNA的表达显著降低(P<0.05);妊娠55天胎儿MyoD1和MRF4mRNA的表达及MyoD1蛋白水平显著降低(P<0.05),且IGF-1mRNA的表达有降低的趋势(P=0.083);妊娠90天胎儿脐带血T3含量和背最长肌中 LDH 活性、线粒体 DNA(mtDNA)含量、NAD+/NADH 比值、MyHC-Ⅱa、MyHC-Ⅱx和线粒体生物合成相关基因(PPARγ辅激活因子1α(PGC-1α)、Sirt1、NRF-1、Tfam和F1ATP合成酶β亚基(β-F1-ATPae))mRNA的表达以及MyoD1、Myogenin和Fast-MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05);妊娠35天、55天和90天各处理组背最长肌中生脂基因表达没有显著差异(P>0.05)。(3)与LE组梅山母猪相比,高能组妊娠90天母猪体增重显著增加(P<0.05)。与LE组梅山猪胎儿相比,高能组妊娠55天和90天胎儿体重显著增加(P<0.05):妊娠 35 天胚胎背最长肌中Pax7、MyoD1、Myogenin、Myf5、IGF-1、IGFBP5、MyHC-embryonic、MyHC-perinatal、MyHC-I、MyHC-Ⅱa、MyHC-Ⅱx 和 MyHC-Ⅱb mRNA 的表达极显著降低(P<0.01);而妊娠55天胎儿Myogenin、CKM和IGF-1R mRNA的表达显著增加(P<0.05);妊娠55天和90天胎儿脐带血T3含量、背最长肌中蛋白含量、CK活性和Myogenin蛋白水平显著增加(P<0.05);妊娠90天胎儿脐带血T4含量、背最长肌中DNA含量、ICDH和柠檬酸合酶(CS)活性、mtDNA含量、NAD+/NADH比值(P<0.05)和 Pax7、MyoD1、Myogenin、Myf5、MRF4、CKM、GHR、IGF-1、PPARγ、aP2、MyHC-embryonic、MyHC-perinatal、MyHC-I2、及线粒体生物合成相关基因(PGC-1α、Sirt1、NRC-1、Tfαm、β-F1-ATPae和细胞色素C(Cyt C)mRNA的表达以及Fast-MyHC蛋白水平显著增加(P<0.05),而MyyHC-ImRNA的表达极显著降低(P<0.01)。本试验结果表明,妊娠不同时间点大白猪和梅山猪胎儿骨骼肌发育相关基因的表达模式存在显著的差异,与梅山猪相比,大白猪胎儿表现出更强的生肌能力和更高的肌纤维分化程度;增加妊娠期大白母猪能量摄入水平推迟了胎儿骨骼肌的分化和成熟,其机理与高能摄入降低生肌因子和fast-MyHC表达有关;增加妊娠期梅山母猪能量摄入水平抑制了早期胚胎生肌前体细胞成肌分化,但促进了后期胎儿骨骼肌的生长发育。试验二母体能量摄入水平对猪胎儿肌肉来源间充质干细胞增殖和分化能力的影响试验一的结果表明增加妊娠期大白母猪能量摄入水平显著推迟了胎儿骨骼肌的分化和成熟。因此,为进一步弄清母体能量水平调控胎儿骨骼肌细胞增殖和分化能力的分子机制,本试验在试验一的基础上以原代分离培养的大白猪胎儿肌肉间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)为模型,探讨了不同母体能量摄入水平对胎儿肌肉MSCs增殖能力和定向成肌成脂分化潜能的影响。试验处理与饲养管理同试验一。在妊娠55天时,HE组和CON组分别选取4头母猪麻醉后屠宰,暴露子宫并取出胎儿。每头母猪选取1头接近平均体重的胎儿转入无菌操作台,原代分离培养胎儿背最长肌来源MSCs,使用传代培养3代以上的细胞进行增殖能力和分化潜能的比较。结果显示:1)HE组和CON组胎儿肌肉MSCs均强阳性表达间充质干细胞特征分子标志CD29和CD90(阳性表达率均在98%以上),不表达内皮祖细胞和内皮细胞标志CD31和CD34(阴性表达率均在99%以上)。2)以相同密度接种细胞后,HE组MSCs在培养96h后细胞数目显著低于CON组(P<0.05),并且细胞倍增时间显著高于CON组(P<0.05)。3)MSCs成肌诱导21天后,与CON组相比,HE组MSCs成肌分化特异性标志基因MyoD1、Myf5、Myogenin和Desmin mRNA的表达显著降低(P<0.05)。而在成脂诱导21天后,各处理组间成脂分化特异性标志基因PPARγ和CEBPamRNA的表达没有显著差异(P>0.05),HE组和CON组油红O染色和异丙醇洗脱测定吸光值也无明显差异。这些结果表明,与正常能量组相比,提高大白母猪能量摄入水平显著降低了胎儿肌肉MSCs的增殖能力和成肌分化潜能。试验三母体高能饲粮添加白藜芦醇对小鼠子代骨骼肌和脂肪组织发育的影响本试验旨在考察母体妊娠期和泌乳期高能饲粮添加白藜芦醇(RES)对小鼠子代骨骼肌和脂肪组织生长发育的影响,并探讨RES的作用效果及其机制。试验选用40只3月龄的健康C57BL/6J雌鼠,配种后随机分为4个处理组:对照组(CON)、对照添加0.2%白藜芦醇组(CON+RES)、高能组(HFD)和高能添加0.2%白藜芦醇组(HFD+RES)。每个处理10个重复,每个重复1只妊娠母鼠。各处理组妊娠母鼠在整个妊娠期和泌乳期均饲喂相应饲粮。断奶后,将全部母鼠屠宰收集组织及血清样品。此外,每窝选择一只接近平均体重的雄性断奶仔鼠进行屠宰,收集血清和肌肉及脂肪组织样品。各处理组剩余雄性仔鼠均饲喂高能饲粮(HFD),在持续11周高能应激后检测成年仔鼠生理代谢指标、葡萄糖耐受和冷刺激耐受能力,测定结束后将所有成年仔鼠屠宰,收集血清、肌肉和脂肪组织样品。试验结果如下:(1)与CON和CON+RES组相比,HFD组母鼠体重、白色脂肪指数、血清甘油三酯和胰岛素含量显著增加(P<0.05),哺乳仔鼠体重、白色脂肪指数、血液葡萄糖含量、血清甘油三酯和胰岛素含量显著增加(P<0.05),成年仔鼠体重、白色脂肪指数、血清甘油三酯和胰岛素含量显著增加,胫骨前肌和腓肠肌指数显著降低(P<0.05);与HFD组相比,HFD+RES组断奶时母鼠体重、白色脂肪指数、血清甘油三酯和胰岛素含量显著降低(P<0.05),哺乳仔鼠白色脂肪指数、血清甘油三酯和胰岛素含量显著降低(P<0.05),成年仔鼠体重、白色脂肪指数和血清甘油三酯和胰岛素含量显著降低(P<0.05),并达到与CON组和CON+RES组相当的水平,胫骨前肌和腓肠肌指数显著增加(P<0.05)。(2)与CON或CON+RES组相比,HFD组哺乳仔鼠肌肉Pax7和MyoDmRNA的表达以及MHC蛋白水平显著降低(P<0.05),成年仔鼠肌肉Pax7、MyoD、Myf5和MyogeninmRNA的表达及Myogenin和MHC蛋白表达显著降低(P<0.05);与HFD-组相比,HFD+RES组哺乳仔鼠肌肉Pax7和MyoDmRNA的表达以及MHC蛋白水平显著增加(P<0.05),成年仔鼠肌肉Pax7、MyoD和Myf5mRNA的表达及Myogenin和MHC蛋白水平显著增加(P<0.05)。(3)与HFD组相比,HFD+RES组哺乳期和成年仔鼠棕色脂肪细胞体积及脂滴空泡明显变小,并与CON组和CON+RES组脂肪细胞形态相似,免疫组化进一步显示UCP1蛋白表达显著增加;与CON或CON+RES组相比,HFD组哺乳仔鼠棕色脂肪组织中产热相关基因(解偶联蛋白1(UCP1)、PR结构域蛋白16(PRDM16)、诱导细胞死亡DNA片段化因子α样效应因子A(Cidea)、极长链脂肪酸延长因子3(Elovl3)、,细胞色素C氧化酶亚基7a多肽1(Cox7a1)和PGC-1α)mRNA的表达显著降低(P<0.05),而与HFD组相比,HFD+RES组中这些产热相关基因mRNA的表达显著增加(P<0.05);与CON组或CON+RES相比,HFD组哺乳仔鼠棕色脂肪组织中UCP1、PRDM16、Sirt1和p-AMPKα蛋白水平显著降低(P<0.05),且成年仔鼠棕色脂肪UCP1蛋白水平显著降低(P<0.05),而与HFD组相比,HFD+RES组哺乳仔鼠棕色脂肪UCP1、PRDM16、Sirt1和p-AMPKα蛋白水平显著增加(P<0.05),且成年仔鼠棕色脂肪UCP1蛋白水平显著增加(P<0.05)。(4)与HFD组相比,HFD+RES组哺乳仔鼠腹股沟和附睾白色脂肪组织中可见类似棕色脂肪的米色脂肪细胞,并与CON组和CON+RES组脂肪细胞形态相似,UCP1免疫组化染色呈阳性。而仅在HFD+RES组成年仔鼠腹股沟白色脂肪中可见相似的变化;与CON组或CON+RES组相比,HFD组哺乳仔鼠腹股沟和附睾白色脂肪产热相关基因(UCP1、PRDM16和Elovl3)和米色脂肪标志基因CD137mRNA的表达显著降低(P<0.05),与HFD组相比,HFD+RES组哺乳仔鼠白色脂肪中这些基因的表达显著增加(P<0.05);与HFD组相比,HFD+RES组哺乳仔鼠腹股沟和附睾白色脂肪中UCP1、PRDM16、CytoC、Sirt1和p-AMPKα蛋白水平显著增加(P<0.05),而成年仔鼠仅腹股沟白色脂肪中UCP1蛋白水平显著增加(P<0.05)。(5)与HFD组相比,HFD+RES组成年仔鼠葡萄糖耐受能力明显提高;与CON组或CON+RES组相比,HFD组成年仔鼠氧气消耗和产热量显著降低(P<0.05),呼吸交换率显著提高(P<0.05);与HFD组相比,HFD+RES组成年仔鼠氧气消耗和产热量显著提高(P<0.05),且呼吸交换率有降低的趋势(P=0.095)。在冷刺激作用下,HFD+RES组成年仔鼠直肠温度显著高于HFD组(P<0.05)。这些结果表明,妊娠期和泌乳期母鼠高能饲粮添加RES提高了仔鼠肌肉中生肌因子和MHC的表达,改善了骨骼肌的生长发育;增强了仔鼠棕色脂肪组织的产热功能,促进了白色脂肪组织的棕色化转变,显著提高了机体的能量消耗,有效降低了高能应激下仔鼠的肥胖和胰岛素抵抗,有利于子代的健康。RES的作用机制可能与AMPK/Sirt1信号通路的激活有关。综上所述,本论文的主要结论为:(1)妊娠不同时间点猪胚胎及胎儿肌纤维发育相关基因的表达模式存在显著的品种差异;与梅山猪相比,大白猪具有更强的生肌能力和更高的肌纤维分化程度。(2)增加妊娠期大白母猪能量摄入水平推迟了胎儿肌纤维的分化和成熟,其机制可能是高能摄入显著降低了生肌和生长因子表达,抑制了成熟型肌纤维转化,并且损伤了线粒体生物合成和功能。高能组大白猪胎儿肌肉来源MSCs表现出更低的增殖能力和成肌分化潜能。(3)增加妊娠期梅山母猪能量摄入水平抑制了早期胚胎生肌前体细胞向成肌细胞的分化,其机理与高能摄入下调了生肌和生长因子表达有关。但在妊娠中后期,母体高能摄入促进了胎儿骨骼肌的生长发育。(4)母体妊娠期和泌乳期高能饲粮添加RES提高了仔鼠生肌因子表达,改善了骨骼肌的生长发育;促进了棕色和米色脂肪细胞的发育,抑制了白色脂肪组织沉积,显著提高了机体的能量消耗,有效降低了高能应激下仔鼠的肥胖和胰岛素抵抗。RES的作用机制可能是通过AMPK/Sirt1信号通路介导的。