免疫检查点是维持免疫稳态并防止自身免疫发生的重要信号分子,在调节免疫应答和维持自身耐受中发挥重要作用。近年来,针对T细胞免疫检查点的阻断治疗已经在多种肿瘤类型中取得巨大成功,使免疫检查点阻断疗法成为最有前景的肿瘤治疗方法之一。然而,肿瘤细胞不仅逃逸T细胞介导的适应性抗肿瘤免疫,其也高表达固有免疫检查点分子来逃避免疫系统的监视。因此,针对这些固有免疫检查点的阻断药物开发也具有非常重要的临床意义。CD47是在多种肿瘤类型中高表达的固有免疫检查点分子,通过与巨噬细胞表面SIRPα的相互作用,向巨噬细胞传递“don’t eat me”信号,从而使肿瘤细胞逃避巨噬细胞的吞噬清除。研究显示,CD47的高表达与多种肿瘤的恶性表型密切相关并且是不良预后的标志物。阻断CD47/SIRPα信号途径不仅可以促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬,还能激活适应性抗肿瘤免疫,使CD47/SIRPα阻断治疗成为一种有前景的肿瘤治疗方法。目前,针对CD47/SIRPα途径的抑制剂均处于临床前或临床研究阶段,尚无产品获批上市,但随着Forty seven公司CD47人源化单克隆抗体Hu5F9-G4临床研究积极数据的公布,CD47/SIRPα阻断治疗开始成为肿瘤免疫治疗领域的热点。然而,由于CD47广泛表达,靶向CD47的治疗方法在临床使用中可能会面临抗原沉没效应和贫血等问题,使其治疗效果和用药安全性大打折扣。因此,开发与正常细胞表面CD47不结合的肿瘤特异性CD47靶向抗体具有重要的临床意义。通过小鼠杂交瘤和噬菌体展示技术,本课题筛选制备了多个具有高特异性和高亲和力的CD47阻断抗体,并且对其体内外抗肿瘤功能和安全特性进行了评价。1.CD47鼠源单克隆抗体的制备及其抗肿瘤功能和安全特性分析通过哺乳动物细胞表达系统和亲和层析,本课题制备了具有生物学活性的高纯度CD47-Fc和SIRPα-his蛋白。同时,通过慢病毒感染结合流式细胞分选策略构建了稳定表达CD47的CHO细胞系。经小鼠免疫、细胞融合、阳性克隆筛选和多次亚克隆化,成功获得了两株可分泌CD47抗体的杂交瘤单克隆1A5和9B6。选择其中具有阻断活性的9B6进行亚型鉴定、可变区克隆、表达纯化和进一步表征。经鉴定,9B6抗体亚型为小鼠Ig G1,克隆获得的可变区序列为目标序列。9B6与CD47结合的亲和力、阻断SIRPα与CD47结合的活性及促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的功能与阳性对照抗体Hu5F9-G4相当且高于阳性对照B6H12。然而,9B6与人红细胞的结合较强且易于诱导红细胞发生凝集,与阳性对照抗体相比在安全性方面未表现出明显优势。2.CD47纳米抗体筛选及其亲和力成熟纳米抗体具有分子量小、组织渗透性强、稳定性高和易于表达等诸多优势,在肿瘤诊断和治疗领域具有广泛的应用前景。为获得安全有效的CD47纳米抗体,本课题分别对单峰驼和双峰驼高容量天然纳米抗体噬菌体展示库进行了筛选。经筛选和鉴定,获得了13条可与CD47特异性结合的候选纳米抗体序列,其中11条具有不同程度的阻断SIRPα与CD47结合的活性,但它们与CD47结合的亲和力相比阳性对照存在较大差距。本研究进一步选择其中具有相对较高亲和力和阻断活性的1A1和C2H8进行亲和力成熟。经同源建模、分子对接及突变库构建与筛选,获得了亲和力得到明显提升的克隆Z2H2、Z2A11和X2A8,其中Z2H2和Z2A11与CD47结合的亲和力达到与阳性对照B6H12相当的水平。基于亲和力和阻断活性分析,我们选择Z2H2进行进一步体内外抗肿瘤活性评价。3.靶向CD47纳米抗体的体内外抗肿瘤活性及安全性评价通过哺乳动物细胞表达系统,本课题成功制备了具有高纯度的Z2H2与Ig G4Fc的融合蛋白（即Z2H2-G4）并对其进行了体内外功能评价。经流式细胞术检测,Z2H2-G4可以阻断SIRPα与细胞表面CD47的结合;相比同型对照,Z2H2-G4可以促进巨噬细胞对Raji、SKOV3和HCT116细胞的吞噬作用;凋亡检测显示,Z2H2-G4不具备直接诱导肿瘤细胞发生凋亡的能力。安全性方面,Z2H2-G4与人红细胞的结合水平较弱,显著低于Hu5F9和B6H12,而且不会诱导红细胞发生凝集,具有明显的安全性优势。在体外抗肿瘤活性和安全性评价的基础上,本课题进一步构建了Raji尾静脉荷瘤和HCT116皮下荷瘤小鼠模型,并对Z2H2-G4的体内抗肿瘤活性进行了分析。结果显示,相比同型对照,Z2H2-G4在Raji尾静脉荷瘤模型中可以抑制肿瘤生长、延缓肿瘤进展并延长了小鼠生存期。在HCT116皮下荷瘤模型中,Z2H2-G4可以显著抑制肿瘤生长。同时,Z2H2-G4与抗血管生成融合蛋白VEGFR1D2-G4具有协同抗肿瘤活性,两者的联合使用比单独用药能更为显著地抑制肿瘤生长。在此基础上,本课题进一步构建了Z2H2-VEGFR1D2双功能融合蛋白,其可同时结合CD47和VEGF,抑制VEGF诱导的HUVEC增殖和成管,具备促进巨噬细胞吞噬和抑制血管生成的双重抗肿瘤活性。综上所述,本课题同时通过小鼠杂交瘤和噬菌体展示两种技术筛选制备了多个特异性靶向CD47的单克隆抗体。其中,通过小鼠杂交瘤技术制备的单克隆抗体9B6具有高亲和力和阻断活性,可显著促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用,但其与人红细胞结合较强且易于引起红细胞发生凝集,相比阳性对照抗体无明显安全性优势;而通过噬菌体展示技术和亲和力成熟策略获得的CD47纳米抗体Z2H2-G4具有良好的抗肿瘤活性和安全特性。Z2H2-G4与抗血管生成融合蛋白VEGFR1D2-G4在结肠癌荷瘤小鼠模型中存在协同抗肿瘤活性。另外,Z2H2-VEGFR1D2双功能融合蛋白可促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用并抑制血管生成,具有双重抗肿瘤活性。本课题制备的CD47纳米抗体和双功能融合蛋白为肿瘤免疫治疗提供了新的选择和思路,具有进一步开发的价值。