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柑橘是世界第一大水果,年产量超过1.1亿吨,中国是柑橘生产大国(面积第一,产量第二)。世界各国都非常重视柑橘的新品种选育,常规方法的选育中种工作一直在开展,并不断获得新的推广品种。但是,由于柑橘自身的一些生物学特性,如实生苗童期长,遗传背景复杂,杂合程度高,具有多胚性等的影响,常规育种常遇到一些障碍,影响育种进程。随着现代生物技术的迅速发展和遗传转化技术的日益完善,将外源基因导入到柑橘中,定向改良现有品种的目标性状,可为柑橘品种改良提供新的途径。本研究以湖南省主栽柑橘品种及主要砧木品种为研究对象,建立了溆浦甜橙、冰糖橙、辛女椪柑和枳的幼年态材料离体再生体系,以及冰糖橙、纽荷尔脐橙、辛女椪柑成年态节间茎段离体再生体系。采用根癌农杆菌介导的方法,将抗病基因chit42和光敏色素基因phyB导入以上受体材料中,建立了柑橘幼年态和成年态材料的遗传转化体系,获得了一批转化植株,从分子水平、外源基因表达和转化植株生物学特性等方面进行了研究,主要研究结果如下:1、柑橘幼年态材料离体再生体系的建立本研究对溆浦甜橙实生苗上胚轴离体再生系统进行系统研究,筛选出适宜的不定芽诱导培养基(MT+3mg/L 6-BA)、不定芽增殖培养基(MT+1.5g/L麦芽提取物+0.5 mg/L 6-BA)和生根培养基(MT+0.5 mg/L IBA)。冰糖橙、辛女椪柑及枳实生苗上胚轴在以上培养基上均能实现高效再生。2、柑橘幼年态材料遗传转化体系的建立利用农杆菌介导法把chit42基因转入到溆浦甜橙中,详细研究了实生苗遗传转化体系的影响因素,对比分析外植体年龄、农杆菌侵染时间、共培培养基及pH值、共培养时间、外源目的基因等对转化结果的影响,结果表明,30d苗龄上胚轴切段经农杆菌液侵染20min后,转移到共培养基(MT+3mg/L6-BA)中暗培养3d,再转入筛选培养基(MT+3mg/L6-BA+100 mg/L Kan+500mg/L cef)中进行选择培养,抗性芽诱导率可高达27.8%,抗性芽通过茎尖嫁接可实现植株再生。同时,利用类似方法,把chit42基因转入到冰糖橙和椪柑中;把phyB基因导入溆浦甜橙和枳中,共获得了16个转基因株系,已繁育了235株转化植株。3、柑橘成年态节间茎段的离体再生及遗传转化体系建立以纽荷尔脐橙、冰糖橙、辛女椪柑的成年态节间茎段为材料,摸索了节间茎段离体再生体系的影响因素,结果表明,适宜于纽荷尔脐橙和冰糖橙节间茎段不定芽再生的培养基为MS+3mg/L 6-BA;辛女椪柑节间茎段不定芽再生相对较困难,适宜其再生的培养基为MS+1mg/LBA+0.5mg/LNAA。建立了柑橘成年态节间茎段的遗传转化体系,在温室中取半木质化的成年态柑橘枝条,采用改良的预处理灭菌方法F,农杆菌菌液侵染20min,转移到共培养基(MS+1mg/L 2iP+2mg/L IAA+0.5mg/L 2,4-D)上暗培养3d,然后再在筛选培养基(MS+1mg/L BA+30mg/L Kan+500mg/L cef)上进行培养,1个月后获得抗性芽,通过试管茎尖嫁接后获得再生植株。同时,利用类似方法,把chit42基因导入到纽荷尔脐橙、冰糖橙、辛女椪柑中,共获得转化植株15株。4、转phyB基因枳的分子鉴定及生物学特性研究农杆菌侵染后,共获得27株抗性枳再生植株,通过PCR检测后发现其中有5株扩增出phyB基因的特异目的带;RT-PCR分析表明phyB基因在phyB3,phyB4株系枳基因组中能够表达。利用Li-6400光合测定仪对转基因枳进行光合特性测定,结果显示转基因枳光合效率强于对照。此外,转化的枳植株在株高、节间长度、叶面积都比对照小,而叶片着生角度明显增宽。5、转chit42基因柑橘的分子鉴定及抗病鉴定研究利用PCR、Southern杂交、RT-PCR技术对转chit42基因成年态柠檬和幼年态溆浦甜橙进行了分子检测。PCR和Southern杂交分析认为外源chit42基因已整合到了柠檬和溆浦甜橙基因组中,并且在转基因柠檬SR23株系中为三个拷贝,SR24株系中为双拷贝,在溆浦甜橙中为单拷贝;RT-PCR技术研究表明外源基因能够在柑橘基因组中表达。对转chit42基因柠檬进行活体和离体抗炭疽病试验,结果表明转基因柠檬抗炭疽病能力得到明显提高。利用半定量RT-PCR技术检测chit42基因在柠檬中的表达,认为在柠檬接种炭疽病菌处理后48 h,chit42基因表达量高于其他处理时间(24、72h)。此外,转基因植株与未转化植株在其形态特征方面无显著差异。