恶性肿瘤高居人类致死原因的第一位,据世界卫生组织(WHO)统计,死亡人数每年平均710万人,而新发恶性肿瘤病例高达870万,而且这一趋势仍然不断上升。其中肺癌是城市人口中最主要的致死原因,发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。临床上非小细胞肺癌占肺癌患者的87%,因早期缺乏症状,70%肺癌患者发现时已经晚期,失去了手术机会,因此化疗是重要治疗手段之一,5年生存率不到15%。多西紫杉醇是从欧洲水杉中的半合成物中提取出来,是非小细胞肺癌中常用的化学治疗制剂。多西紫杉醇在分子水平上通过与细胞微管蛋白结合,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞发挥抗肿瘤作用。但是该药存在着很多缺陷,尤其是可以引起致命的毒性和严重的副作用,如中性粒细胞减少症、过敏反应、脱发、体液潴留、神经病变等。多西紫杉醇水溶性差,需要Tween80作为溶媒进行助溶,该溶媒可以引起溶血和过敏反应。为了改善多西紫杉醇的肿瘤特异性治疗作用并减少其对正常组织的毒性,诸如纳米粒、脂质体、胶束或树状大分子等纳米药物载体系统被广泛应用。聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚合物(polyethylene glycol-distearoylphosphatidyl ethanolamine conjugate, PEG-DSPE)是一种用于递送药物的纳米载体,属两亲性的聚合物胶束,具有蛋白和细胞低吸收性,无免疫原性和毒性,用于多西紫杉醇的纳米载体具有以下优点:有效改善多西紫杉醇的低溶性,避免Tween80引起的副反应;可以逃避机体内网状内皮系统非选择性清除作用;延长机体内的半衰期并通过渗透滞留增强效应(enhanced permeability and retention effect,EPR effect)选择性积累于实体肿瘤中;高稳定性适于过滤除菌并用静脉注射的方式给药。目前,多种配体或抗体修饰的新型靶向聚合物胶束被研发出来用于增强多西紫杉醇肿瘤靶向作用和效率,这些特异的“靶头”可与肿瘤细胞或肿瘤血管内皮细胞表面高表达的受体或抗原选择性高效结合,增强药物的选择性吸收和有效提高活性。整合素家族是表达于细胞表面参与细胞粘附的一组糖蛋白受体,在激活的内皮细胞、肿瘤血管内皮细胞和恶性肿瘤细胞表面呈高表达状态,包括α5β1,αvβ3,α4β1等,通过粘附作用与细胞外基质结合。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(Arg-Gly-Asp peptide,RGD)是整合素的特异性配体,可以识别细胞表面各种类型的整合素并特异结合,被广泛用于修饰溶瘤细胞作用的病毒载体、药物递送载体、以及肿瘤治疗分子靶向药物、探针、放射性示踪剂上。由于RGD这种特异靶向整合素受体的特性,RGD修饰的药物递送系统成为目前最具开发前景的抗肿瘤靶向治疗途径。基于以上机制,本实验制备了用DSPE-PEG包被的聚合物胶束,并用RGD环肽进行表面修饰,制成具有肿瘤主动靶向作用的RGD环肽修饰的多西紫杉醇靶向聚合物胶束DT-RGD。因为双亲性聚合物胶束PEG-DSPE具有良好生物相容性和生物降解性,由其制备的DT-RGD聚合物胶束可以通过EPR效应,有效延长在机体内的循环时间,并被动靶向富集于肿瘤周围,通过被动靶向效应有效改善DT-RGD的抗肿瘤效率。RGD环肽修饰的靶向聚合物胶束DT-RGD,可以被非小细胞肺癌A549细胞表面的整合素主动识别,通过主动靶向作用,增加多西紫杉醇的吸收和有效增强细胞毒性作用。本文采用体内体外实验系统评价DT-RGD的抗非小细胞肺癌A549的作用及其可能的机制。本研究主要方法和结果:1.成膜水化法制备RGD环肽修饰的多西紫杉醇靶向聚合物胶束(DT-RGD)用环肽RGD (cRGD)与DSPE-PEG-NHS按比例混合,反应产物清水透析以去除杂质,过滤并冻干制成cRGD-PEG-DSPE。多西紫杉醇,PEG-DSPE,cRGD-PEG-DSPE按适当比例共同溶解于乙腈并于旋转蒸发仪上负压旋转蒸发,球形瓶上形成的薄膜在60℃用生理盐水进行水化,形成的聚合物胶束用0.22 μm微孔滤膜过滤去除多西紫杉醇沉淀,过滤并冻干制成DT-RGD。2. DSPE-PEG-cRGD核磁共振谱(1HNMR)分析和显微透射镜法红外检测在核磁共振谱(1H NMR)和显微镜透射镜法红外检测中能观察到cRGD和DSPE-PEG-NHS中的-NHS活性基团结合的特异性改变。δ =7.144ppm是连接聚合物胶束中的PEG和cRGD的化学位移峰,表明DSPE-PEG-NHS与cRGD发生反应形成了靶向聚合物胶束DSPE-PEG-RGD。DSPE-PEG-RGD的红外图谱反映出:3340.9cm-1处的峰是RGD特征伸缩振动峰,证明聚合物胶束中RGD肽的存在,可以证明发生了聚合反应。3.动态光散射法测定DT-RGD的粒径和zeta表征制得的聚合物胶束进行动态光散射和zeta电位分析,采用激光散射粒度分析仪Malvern Zetaszer Nano ZS (Malvern Instrument Ltd, Malvern, UK)进行粒径和多分散度测定及zeta电位。RGD环肽修饰的多西紫杉醇靶向聚合物胶束(DT-RGD)的平均粒径23.0±2.1nm,比多西紫杉醇非靶向聚合物胶束(DT-DSPE) 17.6±1.7nm略大,这可能是因为RGD环肽表面修饰的胶束,使胶束拉伸所致,zeta电位分别为-30至-35mV,说明胶束能够保持分散稳定特性。4.高效液相色谱法(HPLC)和高速离心法测定DT-RGD的载药量和包封率胶束中的多西紫杉醇总量和包封率用HPLC法进行测定,0.5mL载药胶束用三倍体积的乙腈溶解以破坏胶束结构,其中的多西紫杉醇含量用HPLC进行测定。0.5mL载药胶束高速离心,测定上清液中多西紫杉醇含量,载药量和包封率按照公式进行计算。测得的DT-RGD的载药量和包封率分别为97. 37505%, 8.423172%。5.透射电子显微镜观察DT-RGD各取制备的空白和载药纳米胶束冻干粉分别用去离子水稀释,滴加在镀碳膜的铜网上,2%磷酸钨染液负染色,透射电镜Hitachi H-7650, 80 kV条件下,观察纳米粒的形态和大小。可见电镜下纳米粒呈均匀圆形颗粒。6.体外药物释放实验评价DT-RGD的药物释放特点DT-RGD中的多西紫杉醇体外释放实验用1mL的DT-RGD装入透析袋(MWCO 10KD)并浸入含有0. 1%的Tween80的40mL PBS中,恒温振荡。在既定时间点从PBS中取0.5mL样品,并补充相同体积的新鲜PBS。每个样品离心后,上清液中的多西紫杉醇浓度用HPLC进行测定。DT-RGD中多西紫杉醇呈缓慢持续释放特性,释放时间超过24h。7. MTT法测定DT-RGD的细胞毒性作用A549细胞用含10%FBS的RPMI1640培养液200μ L种入96孔板,培养24h贴壁生长后,换含药新鲜培养液后继续培养48h,加入1 mg/mL的MTT后再继续培养4h,小心吸取上清,加入DMSO溶解甲臜,分光光度仪570nm波长下测定吸收率,以对照组细胞吸收率为标准进行比较来测定细胞生存率,重复三次计算平均值。MTT法测定的肿瘤细胞半抑制浓度分别为7.54±0.17μg/mL,5.2314±0.13μg/mL,4.4209±0.15μg/mL。DT-DSPE组和DT-RGD组显示了明显增强的细胞毒性作用,与单纯DT组有显著差异(p<0.01)。8. A549肺癌细胞爬片苏木素-伊红(HE)染色观察A549细胞在12孔板中培养48小时,细胞贴壁生长后,分四组A:Control (加相同体积的培养液);B:单纯DT; C:DT-DSPE; D:DT-RGD,分别加入5μM相应药物,培养48小时后用PBS洗两次,用苏木素-伊红染色,固定后在光学显微镜下观察细胞并照相。与对照组和单纯DT、DT-DSPE组相比,DT-RGD组核固缩、核分裂更明显,细胞间距离更大。9.荧光显微镜观察A549肺癌细胞凋亡用AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒处理A549细胞,荧光显微镜下观察细胞凋亡。适量A549肺癌细胞种入12孔板并培养48h,待贴壁生长后,分四组A:Control (加相同体积的培养液);B:单纯DT; C:DT-DSPE; D:DT-RGD。加入相应剂量的药物,作用48h后,用异硫氰酸荧光素(FITC) 20μL和碘化丙啶(PI) 20μL进行染色,在荧光显微镜下进行观察。DT-RGD组可以观察到更多的晚期凋亡为主的改变。10.流式细胞术检测DT-RGD诱导细胞凋亡的作用和细胞周期阻滞作用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒用来检测5μMDT-RGD,DT-DSPE和单纯DT的诱导细胞凋亡作用,A549细胞药物作用48h后,收集细胞,用各含5μLFITC和PI的500μL细胞结合液悬浮细胞,室温赋予30min后,流式细胞仪488nm波长下进行检测。DT-RGD组较其它组诱导晚期凋亡作用更为显著(p<0.01)。药物诱导作用同上,收集细胞,收集细胞用70%乙醇4℃固定12h后,再用100μL Rnase液(100μg/mL)悬浮,37℃,作用30min,再用400μL的PI在4℃下避光孵育30min,流式细胞仪488nm波长下进行检测,各期细胞所占比例用Modfit软件计算。DT-RGD主要引起G2/M期细胞阻滞,与对照组显著差异(p<0.01),与其它两组有差异(p<0.05)。11.荧光定量RT-PCR法检测对A549细胞的Bcl-2、NFkBp65、VEGF、MMP-9的mRNA表达A549肺癌细胞用相应药物作用后,收集细胞,用Trizol试剂盒提取总RNA,并测定纯度,逆转录合成cDNA,用相应引物经PCR扩增,产物进行Line-gene荧光定量PCR检测系统测定。DT-RGD组与其他三组比较显著下调上述指标的表达(p<0.01)。12.体外损伤愈合实验和Transwell法评价DT-RGD抗A549肺癌细胞侵袭能力损伤愈合实验用来评价药物抗A549肺癌细胞侵袭和转移的能力,适量A549肺癌细胞种入12孔板中,在形成单层细胞后,用Tip头尖端划出一个“一”字人为损伤,然后用含药培养液进行培养,比较四组A549肺癌细胞时间依赖性损伤愈合效果,并用光学显微镜每12h观察,愈合面积变化和细胞数用Image软件测定。DT-RGD组与其他三组比较显著抑制A549肺癌细胞损伤愈合恢复能力(p<0.01 )。对数生长期A549肺癌细胞加入Transwell小室的上室,体积200μL,下室加入含10%FBS的RPMI1640培养液,各组加入相应含药培养基37℃C作用12h,上室中的细胞从上室侵入下室并附着在膜上,用甲醛固定并苏木素染色,随机选取5个视野,在400×光学显微镜下记录细胞数。DT-RGD组与其他三组比较显著抑制A549肺癌细胞穿膜能力(p<0.01 )。13.非小细胞肺癌移植瘤模型评价DT-RGD抗肿瘤效率及毒性5-6周雄性裸鼠被随机分成四组,当体重达到16-18g左右时,用5×106 A549肺癌细胞在右侧胸前皮下注射,当非小细胞肺癌移植瘤体积达到80～100mm3,通过尾静脉注射20mg/kg相应药物,间隔三天给药,共三次,肿瘤体积和体重每三天测定一次。DT-RGD组产生类似于DT-DSPE组的毒副作用,与对照和单纯DT相比毒副作用显著降低(p<0.01), DT-RGD组同其他组相比具有显著的抑瘤作用(p<0.01)。研究结论:1.成功构建RGD环肽修饰的多西紫杉醇靶向聚合物胶束DT-RGD;2. DT-RGD通过下调A549肺癌细胞的Bcl-2和NFkB的mRNA表达来诱导A549肺癌细胞凋亡,抑制A549肺癌细胞的增殖。3. DT-RGD可以显著抑制A549肺癌细胞的VEGF、MMP-9的mRNA表达,有效抑制细胞的侵袭和转移能力。4.在A549肺癌移植瘤模型中,DT-RGD通过主动和被动靶向作用,可以显著抑制肿瘤的生长,毒副作用明显降低。