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目的(1)本试验采用在体酶灌注、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离Kupffer细胞(KCs),比较不同分离方法的KCs得率及纯度,以寻求分离小鼠肝KCs的最佳方法。(2)采用体外培养的小鼠KCs,观察在脂多糖(1ipopolysaccharide , LPS)激活的KCs上GITRL(glucocorticoid induced tumor necrosis factor related protein ligand)的表达情况,采用GITRL基因沉默技术探讨GITRL以及地塞米松(Dex)在KCs激活、凋亡和IDO表达中的作用。(3)建立小鼠毒血症动物模型,观察肝脏损伤、肝脏内GITRL的表达和细胞因子的变化,观察Dex在这些变化中的作用,探讨Dex对毒血症小鼠的保护机制。(4)建立Lewis到Brown Noway(BN)大鼠急性排斥反应肝移植模型,观察肝脏及KCs内GITRL的表达,观察他克莫司(tacrolimus, FK506)对GITRL的影响,探讨FK506抑制急性排斥反应的分子机制。方法(1)胶原酶消化法分离小鼠KCs,根据具体步骤方法不同随机分为4组:不采用胶原酶原位灌注+三层梯度离心组(A)、不采用胶原酶原位灌注+双层梯度离心组(B)、胶原酶原位灌注+三层梯度离心组( C)和胶原酶原位灌注+双层梯度离心组(D)。采用F4/80(BM8)或CD163(ED2)免疫染色及吞墨实验判断细胞纯度和功能,采用台盼蓝拒染实验判断细胞的活力,观察KCs的生存时间及形态变化,观察不同方法的分离效果。(2)分离小鼠KCs并随机分为5组:Control组,只加培养基; LPS组,加入LPS(10μg/ml); LPS+Control siRNA组,转染Control siRNA后同LPS组; LPS+GITRL siRNA组,转染GITRL siRNA后同LPS组; LPS+Dex组,地塞米松(100μmol/L)处理后同LPS组。siRNA(异硫氰酸荧光素标记)转染KCs后24 h通过荧光显微镜鉴定转染效果。LPS刺激24 h后,免疫细胞化学染色、免疫荧光及流式细胞术(FCM)检测GITRL蛋白表达,蛋白质斑迹法(Western blot)检测IDO蛋白表达,FCM检测KCs的凋亡变化,ELISA检测KCs培养上清液肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6、干扰素(IFN)–γ和IL-10表达情况。(3)采用LPS腹腔注射建立小鼠毒血症模型,实验动物分为4组:Control组,腹腔注射生理盐水; Dex组,腹腔注射Dex (3mg/kg);LPS组,腹腔注射LPS (10mg/kg); LPS+Dex组,腹腔注射Dex (3mg/kg)+ LPS(10mg/kg)。于术后腹腔注射后24 h获取肝脏及血液标本,观察肝脏组织病理结构变化,全自动生化分析法测定血清谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶胆红素(AST)、ELISA检测血清TNF-α、IL-6、IFN–γ和IL-10含量,免疫组化法检测肝脏GITRL的表达。观察毒血症小鼠的死亡率。(4)用改良的“两袖套法”建立大鼠原位肝移植动物模型,实验动物分为3组:耐受组, BN大鼠为供体Lewis大鼠为受体;排斥组, Lewis大鼠为供体BN大鼠为受体;FK组,Lewis大鼠为供体BN大鼠为受体,受体术后1-7天以FK506(1 mg/kg)肌肉注射。除观察大鼠存活率外,于术后7 d获取肝脏及血液标本,观察肝脏组织病理变化,全自动生化分析法测定血清ALT和AST变化,ELISA检测血清及细胞培养上清液IFN-γ和IL-10含量,免疫组化检测肝脏及KCs内GITRL的表达。结果(1)在328nm荧光激发下,未见KCs发出荧光。刚分离的KCs细胞近似圆形,接种l h后,此时收获细胞纯度较高,但细胞得率相对较低。KCs培养4 h后得率相对较高,培养2 d及3 d后,细胞贴壁,且充分伸展,可见星形或不规则形,细胞培养4 w仍能存活。体内及体外吞墨实验均见KCs吞噬大量碳素颗粒。台盼蓝染色显示各组细胞的活力均在90%左右。免疫组化染色及免疫荧光显示分离的细胞为KCs。胶原酶灌注和双层梯度离心可以增加KCs的得率,双层梯度离心法可以增加分离KCs的纯度。(2) GITRL siRNA能够高效转染KCs,转染后24 h荧光显微镜下鉴定转染效果达85%。LPS刺激的细胞上GITRL表达明显升高,地塞米松预处理或者GITRL基因沉默可以有效地抑制GITRL的表达。与对照组比较,LPS组及LPS+Control siRNA组IDO蛋白表达及细胞凋亡明显增高,而地塞米松预处理及GITRL基因沉默可以降低LPS诱导的IDO蛋白表达及细胞凋亡。LPS刺激后,细胞培养液的IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-10表达水平明显升高,GITRL基因沉默或者地塞米松预处理后,抑制了LPS诱导的TNF-α和IL-6升高。(3)地塞米松腹腔注射明显降低了小鼠的死亡率、改善肝脏的功能和减轻了LPS诱导的肝损伤。免疫组化染色检测GITRL的表达结果显示腹腔内注射LPS 24 h后肝脏广泛表达GITRL,地塞米松降低了GITRL在肝脏的表达。LPS注射后24 h,血清TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10水平明显升高,地塞米松注射减低了LPS诱导的TNF-α、IL-6和IFN-γ升高。(4)排斥组肝脏损伤重,KCs和肝脏移植物内GITRL的表达升高,和血清TNF-α及表达一致,与血清IL-10表达相反。FK组KCs及肝脏移植物内GITRL的表达降低,和TNF-α及IFN-γ的降低一致,肝脏损伤减轻,大鼠的生存率延长。结论(1)在体酶灌注对提高KCs得率较为重要,双层分离可改善分离效果。(2)GITRL介导了LPS诱导的IDO表达、KCs的凋亡和促炎细胞因子的分泌,地塞米松可以通过下调GITRL抑制IDO表达、KCs的凋亡和促炎细胞因子的分泌。(3)GITRL在内毒素血症相关的肝损伤中具有重要作用,地塞米松在LPS诱导的肝损伤中的保护机制可能是通过下调GITRL的表达来实现的。(4)在免疫排斥组的移植肝脏中GITRL的表达升高和免疫排斥具有相关性, FK506通过抑制KCs上GITRL以维持移植肝脏的成活。