【摘 要】
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该课题在对动物肠道大肠杆菌的FQs靶位基因与非靶位基因突变研究的基础上,建立了PCR错配扩增突变分析法(MAMA-PCR)和变性高效液相色谱(DHPLC)这2种FQs靶位基因突变的快速检测
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该课题在对动物肠道大肠杆菌的FQs靶位基因与非靶位基因突变研究的基础上,建立了PCR错配扩增突变分析法(MAMA-PCR)和变性高效液相色谱(DHPLC)这2种FQs靶位基因突变的快速检测方法.该论文分为以下四个部分.1.动物、人和环境分离的大肠杆菌FQs靶位突变分析利用PCR扩增后直接测序的方法对动物养殖场分离的72株大肠杆菌进行FQs靶位突变分析.这些菌株来源于食品动物(47株)、人(14株)和环境(11株),环丙沙星MIC范围为0.008~>128μg/ml.首次在大肠杆菌中发现编码拓扑异构酶Ⅳ的parC基因第84位密码子的GAA→GCA突变,引起氨基酸替代为Glu→Ala.2.FQs耐药发展过程中的靶位和非靶位基因突变研究.对FQs靶位基因gyrA和parCQRDR区以及非靶位基因marR进行PCR扩增并测序,以调查在大肠杆菌肠道分离株中,靶位突变与非靶位突变的流行状况,并分析二者与FQs耐药及多重耐药表型的关系.并研究在体外诱导实验中,靶位突变与非靶位突变的动态累积过程及与FQs耐药和多重耐药表型的相关性.3.耐FQs大肠杆菌基因突变MAMA-PCR监测方法的建立及应用错配扩增突变分析PCR(mismatch amplification mutation assay,MAMA-PCR)是一种快速、简便、费用低廉的突变检测方法,其原理是根据野生型序列以突变热点为3端设计引物,并在3端第三个碱基引入错配碱基,使突变型因3端2个碱基错配而不能扩增出条带.该研究旨在建立MAMA-PCR监测耐FQs大肠杆菌gyrA和parC基因突变方法,并应用于调查动物分离株耐FQs大肠杆菌gyrA和parC基因突变流行趋势.4.耐FQs大肠杆菌gyrA和parC基因突变的DHPLC检测方法的建立变性高效液相色谱((denaturing high-performanceliquid chromatography,DHPLC)是一种自动、快速、高通量的基因突变筛查技术.目前广泛应用于与疾病相关的基因突变检测和SNP筛查.2002年首次应用于探测抗生素耐药基因的突变.该研究首次将DHPLC技术应用于探测大肠杆菌gyrA和parCQRDR突变.
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