研究背景鼻腔鼻窦恶性黑色素瘤(sinonasal malignant melanoma, SNM)是耳鼻咽喉一头颈外科复发率较高的恶性肿瘤之一,因为该肿瘤容易血行播散,手术后复发率高,预后不良,严重威胁人类的健康。尽管较为完整的手术切除能够有效延缓肿瘤复发时间及延长患者的生存期,但其五年生存率仍低于25%。单纯手术技术的进步看起来很难再进一步改善患者的生存期。鼻腔鼻窦恶性黑色素瘤的治疗是耳鼻喉头颈外科领域毋庸置疑的挑战。肿瘤血管化(tumor vascularization)是肿瘤进展的必要前提,抗血管治疗成为肿瘤靶向治疗的新方向。恶性黑色素瘤(malignant melanoma, MM)的供血模式相对独特,由瘤内已生成的血管和瘤周的新生血管共同作用。传统观念认为肿瘤组织的血液供应来自于血管生成(angiogenesis)。抗血管治疗的研究早期主要是以血管内皮细胞(endothelial cell, EC)为靶点。但是近年来,随着人们对血管化的认识越来越深入,抗血管治疗的研究重点又转移到以非内皮依赖性血管形成的方向上。建立在抗血管生成、抗拟态生成和抗淋巴管生成基础之上的多层次、多靶点化的治疗方案是未来的抗肿瘤血管治疗的最佳策略。癌症是一种微环境和免疫疾病。肿瘤与微环境相互适应、相互作用,甚至相互利用,表现出“亦敌亦友”的关系,呈现高度的动态平衡。肿瘤间质中的炎性细胞以及其分泌的细胞因子是肿瘤的生长、增殖、转移及血管形成的重要来源。巨噬细胞是一种主要的炎性浸润成分,是万能的免疫效应细胞,它既可为免疫系统的正向调控因素,又可发挥负向调控作用。在肿瘤细胞的诱导下,起源于骨髓的单个核细胞可分化形成独特表型的巨噬细胞一一肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage, TAM)。TAM产生大量的细胞因子能促进肿瘤的生长、增殖、转移及血管形成,并抑制T细胞和自然杀伤细胞的抗肿瘤活性,对肿瘤的生长和演变有广泛和复杂的作用。TAM在鼻腔恶性黑色素瘤中的作用目前也还存在争议。有观察认为TAM高浸润是多种肿瘤的不良预后因素,也有研究者提出TAM是良性指标。巨噬细胞究竟是发挥抗肿瘤作用还是促肿瘤作用由其表现的类型决定。微环境的改变被认为是引起巨噬细胞表型转变的主要原因,也被认为是影响肿瘤内皮依赖和非内皮依赖血管化的重要因素,但确切的机制都尚未探明。肿瘤组织中的微环境与正常组织的有明显的差别,缺氧是主要特征之一。缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)在缺氧状态下发挥活性的转录因子,同时被活化,通过介导缺氧反应基因的转录和表达,参与血管生长。基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)是重要的金属酶之一,可降解W型胶原。体内外研究表明,MMP-9在肿瘤发生、发展的多个阶段均有作用,影响肿瘤的生长、血管生成、血管淋巴管浸润和转移。近期的研究发现,TAM通过旁分泌和自分泌HIF-2／MMPs信号途径促进肿瘤的血管生成,与有淋巴管生(lymphangiogenesis)也有一定的关系,但其与血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)等其他血管模式的关系尚无文献证实。鼻腔恶性黑色素瘤中TAM浸润与SNM临床病理特征和预后的观察尚不多见,且肿瘤炎性微环境与SNM血管化关系的研究也少见报道。因此,研究肿瘤炎性微环境中何种因素对TAM表型转化和血管化产生影响,阐明巨噬细胞在微环境中功能变化的分子机制,以发挥其积极作用,激活巨噬细胞的抗肿瘤活性,将可能为未来肿瘤生物治疗提供新的线索。本课题拟系统研究SNM不同肿瘤微环境中的TAM免疫活化状态,全面观察SNM的三种血管化模式,探讨炎性微环境与SNM预后及血管化的关系。第一部分：TAM在鼻腔恶性黑色素瘤中的浸润及临床意义目的从细胞和基因水平探索鼻腔恶性黑色素瘤病人瘤内和瘤周微环境中肿瘤相关巨噬细胞的分布特点和表型变化,了解SNM患者的巨噬细胞免疫活化状态。同时,探讨TAM浸润与SNM临床病理特征的关系和早期SNM患者生存和预后的影响。方法回顾性分析山东大学齐鲁医院耳鼻喉科1985年一2008年收治的45例鼻腔鼻窦恶性黑色素瘤患者患者的临床病理资料,进行随访,选取手术后的鼻腔恶性黑色素瘤组织标本。应用免疫组织化学技术测定SNM瘤内和瘤周组织CD68标记的TAM的表达。并进行比较,了解两组间有无差异。探讨TAM浸润与SNM临床病理特征的关系以及TAM浸润对早期SNM患者生存和预后的影响。macrophage可以分为M1和M2两个亚类,应用免疫荧光双染标记M1的特异性标记物iNOS (Inducible nitric oxide synthase,诱导型一氧化氮合成酶)和M2的特异性标记物CD206,明确M1,M2在瘤周和瘤内的分布特点和表型变化,以便了解SNM患者巨噬细胞的免疫活化状态。结果1.各组病例的临床资料(略)2.免疫组化染色成功的45例SNM瘤内和瘤周组织中均能见到TAM浸润。SNM瘤内TAM平均计数为13.3±7.3macrophages/0.155mm2,明显低于瘤周的TAM平均计数20.1±10.0macrophages/0.155mm2,具有统计学差异(P<0.01)。即在瘤内组织中的TAM浸润更密集。用聚类分析法可将TAM计数聚为低密度和高密度组类,经检验得出CD68在SNM瘤内和癌周组织中的表达存在统计学差异(P<0.01),这与TAM计数方差分析结果一致。3.对SNM组病例的各种临床病理特征与TAM浸润的关系进行单因素分析,发现TAM浸润与临床分期、肿瘤Breslow浸润厚度和肿瘤侵袭性有关。高侵袭性的SNM中,TAM浸润与血管生成拟态相关。4.瘤内微环境中,45例病人SNM组织中TAM均同时表达CD68和CD206,CD206阳性巨噬细胞占全部TAM的69%-85%；有5例SNM患者TAM同时表达CD68和iNOS,占全部TAM的11.1%。癌周微环境中,37例(82.2%)SNM患者同时表达CD68和iNOs,8例(17.8%)仅表达CD68；未见有同时表达CD68和CD206的病例。表明不同肿瘤微环境对巨噬细胞表型转化的具有影响：在瘤内微环境中巨噬M2型转化,而在瘤周微环境中巨噬细胞向M1型转化。5.选取SNM早期(Ⅰ／Ⅱ期)患者共33例,以TAM浸润密度的中位数为界,将其分为TAM低密度组与TAM高密度组。Log-Rank检验分析发现瘤内微环境中巨噬细胞的密度与早期SNM患者的平均总生存期相关(P=0.036),瘤内TAM低密度组患者的生存期(median,57 months)明显高于瘤内TAM高密度组患者(median,13 months)。而瘤周微环境中TAM密度对早期SNM患者的平均总生存期无意义(P=0.408)。表明瘤内TAM浸润密度是影响早期SNM患者生存的独立的预后因子。结论1.鼻腔鼻窦恶性黑色素瘤组织中TAM明显浸润,瘤周组织中TAM的浸润密度比瘤内高。2.鼻腔鼻窦恶性黑色素瘤组织中TAM浸润密度与与临床分期、肿瘤Breslow浸润厚度和肿瘤侵袭性有关。在高侵袭性的SNM中,TAM浸润与血管生成拟态相关。3.肿瘤微环境对巨噬细胞表型转化的具有影响：在瘤内微环境中巨噬M2型转化,而在瘤周微环境中巨噬细胞向M1型转化。4.瘤内TAM浸润密度是早期SNM患者的独立预后因子。第二部分：肿瘤微环境对鼻腔恶性黑色素瘤血管化的影响及其机制探讨目的观察鼻腔鼻窦恶性黑色素瘤的三种最关键的血管化模式(血管生成、淋巴管生成和血管生成拟态)。从细胞和基因水平联合测定SNM瘤内和瘤周TAM浸润、MMP-9及HIF-2α的表达,并探讨TAM-MMP-9／HIF-2α与SNM血管化的关系,初步阐明肿瘤炎性微环境对SNM血管化的影响和信号机制。方法回顾性分析山东大学齐鲁医院耳鼻喉科1985年一2008年收治的45例鼻腔鼻窦恶性黑色素瘤患者患者的临床病理资料,进行随访,选取手术后的鼻腔恶性黑色素瘤组织标本。定量观察SNM瘤内和瘤周组织三种主要的血管化模式：包括CD34标记的微血管生成密度,D2-40标记的淋巴管计数和PAS／CD34双标的血管生成拟态。从细胞和基因水平联合测CD68、MMP-9及HIF-2α的表达。探讨TAM-MMP-9／HIF-2α与SNM血管化的相关性结果1.SNM瘤内组织标本中观察到了内皮依赖性血管、内皮依赖性淋巴管和血管生成拟态三种血液供应模式。瘤周组织只见内皮细胞依赖性血管和内皮细胞依赖性淋巴管两种血液供应模式,未见血管生成拟态结构。2.CD34标记的MVD在SNM瘤内组织和瘤周组织分别为17.7±2.3和23.2±7.3,两组的数值存在统计学差异,P<0.05。在45例鼻腔恶性黑色素瘤组织中有11例(24.4%)存在血管生成拟态。D2-40标记的LVD在SNM瘤内组织和瘤周组织分别为2.1±3.7和1.7±6.3,数值差异无统计学意义,P>0.05。3.CD68、MMP-9和HIF-2α三者在鼻腔恶性黑色素瘤中的表达部位有相似性。45例SNM中MMP-9总阳性率为75.6%(34／45),HIF-2α总阳性率为40%(18／45)。应用免疫组化图象分析软件对SNM瘤内和瘤周区域的MMP-9和HIF-2α进行半定量比较,发现SNM瘤内MMP-9和HIF-2α阳性颗粒的强度均值、阳性面积及强度均值×阳性面积均比瘤周区域明显增加,差异有统计学意义,P<0.05。4.瘤内微环境中TAM计数与MVD、VM和LVD密度无显著相关；但是HIF-2α阳性的IT-TAM计数与MVD呈显著相关(r=0.871,P=0.01),与VM成轻度正相关,但未见相关的显著性(r=0.464,P=-0.056)。瘤周微环境中TAM计数与MVD和LVD密度无显著相关。5.瘤内微环境中HIF-2α与瘤内MVD呈正相关(r=0.558,P=0.039),与瘤内VM和LVD无显著相关。瘤周MVD和LVD与HIF-2α蛋白表达水平无显著相关。6.瘤内微环境中MMP-9和MVD密度正相关(r=0.513,P=0.049)；与瘤内VM和LVD无显著相关。瘤周微环境中MMP-9蛋白与LVD显著相关(r=0.671,P=0.014)。MMP-9的表达与CD68的表达呈正相关,P=0.022。结论1.微血管在SNM的发生发展中发挥重要作用；但微淋巴管SNM的发生发展中作用不能确定。2.TAM的浸润可能尚不足以引起SNM血管和淋巴管的生成,但TAM可以通过上调HIF-2α的表达,促进微血管和血管生成拟态生成。3.MMP-9和TAM在鼻腔鼻窦恶性黑色素瘤血管化过程中有协同作用。MMP-9参与SNM瘤内及瘤周组织的微血管生成,也影响瘤周淋巴管的生成,是影响SNM血管化的重要因素。4.肿瘤炎性微环境通过TAM-MMP9／HIF-2α通路对SNM血管化产生重要影响,该结果揭示了抑制肿瘤炎性微环境是控制肿瘤血管生成和生长的新靶点。