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目的:1.应用TaqMan探针实时荧光PCR技术(RT-qPCR),建立大肠埃希氏菌的快速定量检测方法。2.优化水中细菌富集和DNA提取方法,以便应用RT-qPCR方法的进行水中大肠埃希氏菌的检测。3.采用RT-qPCR和多管发酵法同时检测实际水样,验证RT-qPCR方法的准确性。方法:1.根据大肠埃希氏菌的ydiJ基因,设计引物和探针,并分析其特异性和灵敏性。2.将分离的目标片断与T载体连接重组,制备大肠埃希氏菌的质粒DNA标准品。3.优化RT-qPCR反应检测体系,建立标准曲线,并进行方法学评价。4.通过比较各种水中细菌富集和DNA提取的方法,确定最佳前处理方法组合。5.采用RT-qPCR检测20份水样,所得结果与多管发酵法比较,以验证所建立方法的准确性。结果:1.引物ydiJ577的特异性实验结果表明,所有的大肠埃希氏菌和志贺氏菌标准菌株均为阳性,9株其它非大肠埃希氏菌标准菌株均为阴性;2.制备大肠埃希氏菌的质粒DNA经测序比对,结果: Identities=90/91(99%),Gaps=0/91(0%)。,标准品纯度:OD260/OD280=0.047/0.026=1.813.加标水源水经膜洗脱(L型棒洗脱法),磁珠法提取DNA,所建立的标准曲线线性范围2.3×100~2.3×106CFU/mL (R2:0.996)、检测限可达到2.3CFU/mL。4. RT-qPCR和多管发酵法检测实际水样所得结果具有相关性,r=0.991, P<0.01结论:1. RT-qPCR方法有很好的特异性,能够快速、准确地检测水中大肠埃希氏菌。2. RT-qPCR方法特别适合在中高程度污染的水样中定量检测大肠埃希氏菌。3. RT-qPCR法可以作为现行标准方法的补充,能够更加准确、及时地评价水体受粪便污染程度。