论文部分内容阅读
本研究在已经克隆并表达了抗人脑胶质瘤单链抗体SZ39-ScFv的基础上,构建了抗人脑胶质瘤重组免疫毒素SZ39(ScFv)-PE40,并在大肠杆菌中得到了高效的表达,初步证实其具有结合胶质瘤细胞SHG-44的活性,为进一步研究开发抗胶质瘤重组免疫毒素打下了基础;另外,本研究还构建并原核表达了人源化抗CD3单链抗体,为进一步构建抗CD3/抗胶质瘤双特异性抗体作了必要的准备工作。第一部分人源化抗CD3单链抗体的构建和表达目的:在以前的工作中,我们通过化学偶联的方法制备了抗CD3/抗胶质瘤双特异性抗体,并在体外细胞毒试验及荷瘤动物实验中取得了较好结果,但存在着分子量大、制备困难等缺点。本实验构建并表达了人源化抗CD3单链抗体,旨在为构建新一代的小分子、高效的基因重组抗CD3/抗胶质瘤双特异性抗体提供一个合适的构件。方法:从质粒pZZ3中克隆出人源化抗CD3抗体的VH、VL基因,并经测序证实;分别与编码Linker即(Gly4Ser)3的基因连接,构建出人源化抗CD3单链抗体基因,分别将其克隆入大肠杆菌融合表达载体pGEX-5X-1及分泌型表达载体pET20b(+)中,并分别转化大肠杆菌BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysS。经IPTG诱导表达,以12% SDS-PAGE分析表达产物,以Western blot证实。结果:SDS-PAGE分析表明经融合表达载体pGEX-5X-1表达的融合蛋白分子量为55KD,经pET20b(+)表达的产物分子量为35KD,分别与其理论推算值相符。表达形式均以包涵体为主,表达量均占菌体总蛋白的30%左右。Western blot证实诱导后菌体总蛋白分别在55KD和35KD处出现特异性显色印迹。结论:人源化抗CD3单链抗体可以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达。第二部分抗人脑胶质瘤重组免疫毒素SZ39(ScFv)-PE40的基因构建及表达目的:构建抗人脑胶质瘤重组免疫毒素SZ39(ScFv)-PE40并在大肠杆菌中表达。方法:从质粒pVC85中克隆出PE40基因,与抗胶质瘤单链抗体SZ39-ScFv基因进行拼接,构建出重组免疫毒素SZ39(ScFv)-PE40基因,并将其克隆于表达载体pET20b(+),在大肠杆菌Bl21(DE3)pLysS