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以采自贵州、云南、四川、广东四省的17种植物(隶属于14科15个属)为材料,用超声波提取法乙醇提取,采用菌丝生长速率法对荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora litchii Chen.)、芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、香蕉炭疽病菌(Calletotrichum musae)、香蕉枯萎病菌(Banana vascular)、草莓灰霉病菌(Bortrytis cinerea)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveumSnyder)和黄瓜疫霉病菌(phytophthora melonis)八种病原菌进行了抑菌谱筛选。
试验结果表明:毛轴蕨、山苍子具有显著的抑菌活性,1.5mg/mL毛轴蕨乙醇粗提物对黄瓜疫霉病菌、香蕉炭疽病菌和草莓灰霉病菌菌丝生长的抑制率达到100%:对供试的水稻纹枯病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉病菌、芒果炭疽病菌和西瓜枯萎病菌的菌丝生长抑制率分别是86.21%、74.84%、73.23%、69.36%和43.33%。1.5mg/mL山苍子乙醇粗提物对香蕉炭疽病菌和水稻纹枯病菌的菌丝生长抑制率达到100%,对黄瓜疫霉病菌的菌丝生长抑制率为93.97%,对其他几种供试菌株的菌丝生长抑制率都在50%以上;活性其次的是加拿大一枝黄花、迷迭香、龙柏和酸模叶蓼的粗提物。2.0mg/mL加拿大一枝黄花粗提物对香蕉炭疽病菌、黄瓜疫霉病菌、草莓灰霉病菌的菌丝生长抑制率分别为:93.46%、72.58%、62.27%。0.2mg/mL迷迭香粗提物对水稻纹枯病菌、草莓灰霉病菌、荔枝霜疫霉病菌的菌丝生长抑制率分别是:71.01%、51.70%、50.00%。2.0mg/mL龙柏对水稻纹枯病菌的菌丝生长抑制率是52.85%。2.0mg/mL酸模叶蓼粗提物对草莓灰霉病菌的生长抑制率分别是50.36%。余下的几种植物活性较低,大多数对供试病原菌的生长抑制活性低于30%。
以对毛轴蕨最敏感的香蕉炭疽病菌作为指示菌,进一步确定了毛轴蕨活性物质主要存在于幼苗乙醇粗提物中。试验结果显示:处理72小时后,1mg/mL幼苗、叶、茎、根乙醇粗提物对供试菌的生物活性依次递减,菌丝生长抑制率分别是100%、39.25%、16.00%、15.00%。
选择毛轴蕨幼苗分离活性成分,将乙醇粗提物依次用石油醚、二氯甲烷、甲醇—水萃取后,二氯甲烷萃取物具有较强抑菌活性。它们对香蕉炭疽病菌的菌丝生长抑制率分别是69.49%、7.76%、14.67%。
采用硅胶柱层析、凝胶柱层析和薄层制备的方法,结合生物活性追踪,从毛轴蕨幼苗中追踪分离得到活性化合物JC—S1,在追踪分离目标化合物的同时,还得到其他5个化合物JC—S2~JC—S6。活性化物JC—S1用HPLC—MS和NMR解析化学结构,在此基础上与中国科学院昆明植物所提供的标准品进行TLC的对照试验,证实该化合为β—谷甾醇。其余的5个化合物采用GC—MS分析,参照wely化合物质谱数据库确定其结构。
本研究首次从毛轴蕨植物中分离得到β—谷甾醇,发现其对香蕉炭疽病菌具有显著的抑菌活性,抑制中浓度IC50为0.128 mg/mL。β—谷甾醇为已知化合物,在医药方面主要用于降低血脂和胆固醇。根据其长期的临床应用,证明其安全可靠,是一种颇具农药潜力的化合物。