论文部分内容阅读
脑血管疾病严重危胁人类健康。研究发现,缺血性脑中风已成为当今第三大致死原因及首位致残原因,开发有效抗脑缺血药物是脑血管研究领域的重要课题。双苯氟嗪(dipfluzine, DIP)是由河北医科大学药学院研制的氟桂嗪类L型钙通道拮抗剂[1]。药效学研究发现其对缺血性脑损伤具有保护作用,可增加脑血流量,缩小脑梗塞面积,减轻脑水肿等[2]。Jin等[3]的实验结果证实 ,脑缺血再灌注损伤时激活 CD95 (Fas) 分子,其可通过启动细胞死亡信号转导通路而介导海马CA1区神经元延迟性死亡。然而,DIP的脑保护作用与CD95分子的关系、及CD95分子表达的基因调控机制即DIP通过那些转录途径影响CD95分子的表达等尚不明了。众所周知,Ca2+在脑缺血再灌注损伤中起关键性作用。同样,在T淋巴细胞凋亡诸多相关信号转导通路中,由Ca2+诱发的Ca2+/CaMK-Calcineurin-NFAT-CD95分子通路受到高度关注,近年大量的文献资料便可明证[4-7]。细胞内Ca2+的增加通过钙调蛋白(Calmodulin, CaMK)激活胞浆中的丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶(Calcineurin),后者使转录因子NFAT(nuclear factor of activated T-cells)脱磷酸化,使之从胞浆转移至细胞核内,从而促进CD95分子的基因转录及T淋巴细胞的凋亡。尽管存在不同的实验结果及其它可能的信号转导途径[8, 9],但有一点可以肯定,即Ca2+/CaMK-Calcineurin-NFAT-CD95分子通路的激活是T淋巴细胞凋亡的重要机制。那么,这种信号通路的激活是否亦是脑缺血再灌注损伤的原因呢?迄今为止,此方面研究报道甚少。Graef等[10]的实验表明,在培养的海马神经元细胞,Ca2+/CaMK-Calcineurin-NFAT通路的激活严格依赖于通过L-型电压门控钙通道的Ca2+电流,而细胞核内的蛋白激酶如糖元合成酶-3 (GSK-3)则通过NFAT的磷酸化从而拮抗NFAT的基因转录功能。Uchino等[11, 12]的实验也发现,Calcineurin的抑制剂对抗大鼠在体(in vivo)脑缺血再灌注损伤,具有神经保护作用。这些实验结果提示Ca2+/CaMK-Calcineurin-NFAT-CD95分子通路可能参与了脑缺血再灌注损伤。 <WP=5>我们知道,转录因子NF-κB受外界刺激因素活化后,作用于靶基因,可迅速诱导基因表达。实验证实[13],NF-κB通过对基因(如iNOS, TNF-α 等)表达的调控从而调节免疫及炎症反应,而iNOS, TNF-α等的表达反过来刺激NF-κB的进一步活化,从而形成正反馈效应,造成组织损伤。实验表明,NF-κB的激活具有两面性,即NF-κB短暂的激活具有神经保护作用,而持续的激活则可能损伤组织[14, 15]。Shen 等[16]的实验证实NF-κB参与了脑缺血再灌注损伤,具有神经保护作用。新近,我们也在大鼠脑缺血再灌注损伤模型发现DIP能够抑制CD95分子的表达。根据以上的预实验结果我们提出,同T淋巴细胞凋亡机制的产生一样,转录因子NF-κB或/和Ca2+/CaMK-Calcineurin-NFAT-CD95分子通路可能参与了脑缺血再灌注损伤。DIP通过抑制L-型钙通道的钙电流,调节NF-κB的DNA结合活性;抑制Calcineurin的活性和/或表达,或增强GSK-3的活性和/或表达;调节NFAT的DNA结合活性,从而抑制CD95分子诱导的细胞凋亡,发挥抗脑缺血再灌注损伤作用。为验证我们上述的假说,本研究将采用免疫组织化学技术,流式细胞学技术,激光共聚焦显微镜及分子生物学技术等,利用大鼠脑缺血再灌注损伤模型评价:(1)DIP在在体脑缺血再灌注损伤中的作用;(2)DIP与死亡信号转道通路之间的关系;(3)转录因子NFATc及NF-κB在脑缺血再灌注损伤中的作用;(4)Calcineurin, GSK-3在脑缺血再灌注损伤中的作用,并探讨DIP的基因转录抑制功能。这些将对阐明DIP抗脑缺血-再灌注损伤的分子机制提供重要的理论依据。DIP在在体(in vivo)脑缺血再灌注损伤中的作用10~12周龄,体重250~300克SD雌性大鼠,四血管阻断法制备全脑缺血再灌注损伤模型(缺血15 min,再灌注三天),双苯氟嗪(20 mg/kg,40 mg/kg和80 mg/kg)灌胃给药,每日一次。研究结果显示: (1) 共聚焦显微镜扫描技术(Confocal)观察AO/EB双莹光染色海马神经元:假手术组以正常海马神经元(核发黄绿色-黄色荧光,密度不均,呈结构样特征)居多,有少量早期凋亡的海马神经元(核荧光亢进,呈均匀一致的绿色);溶剂组多见晚期凋亡的海马神经元(核呈橙红色,可见核的断裂和浓缩);与溶剂组相比较,双苯氟嗪组明显降低晚期凋亡海马神经元的数量; (2) HE染色:可见假手术组海马CA1区神经元细胞核大小较均匀,圆<WP=6>形或椭圆形,染色质分布均匀,细胞核呈蓝黑色,胞浆呈淡红色。缺血再灌注组细胞皱缩、变形,核染色质致密浓缩、边集,部分核碎裂等。给予双苯氟嗪后呈现凋亡形态学改变的海马神经元细胞数量明显减少; (3) 流式细胞仪(FCM)分析海马DNA含量变化,与缺血再灌注组相比较,双苯氟嗪各剂量组明显降低海马神经元细胞凋亡百分率(P<0.01),且具剂量相关性(r = - 0.865,P< 0.05),分别为假手术组3.7 ± 0.6, 溶剂组17.7 ± 1.0, 双苯氟嗪小剂量组9.5 ± 0.7, 中剂量组8.9 ± 1.9大剂量组8.0 ± 0.3。以上结果表明,双苯氟嗪可对抗在体脑缺血再灌注损伤,降低海马CA1区神经元细胞凋亡率,具有脑保护作用。DIP与死亡信号转道通路之间的