论文部分内容阅读
蚊虫作为重要的病原体传播媒介,传播疟疾、登革热、黄热病、寨卡等多种虫媒传染病,给全球公共卫生事业带来了巨大威胁。伊蚊作为登革病毒的主要传播媒介,具有分布范围广、传播效能高等特点。登革病毒感染会引起登革热,甚至更严重的登革出血热和登革热休克综合征等疾病。目前该蚊媒病没有有效的疫苗和抗病毒药物,并且由于抗体依赖增强引起的继发感染风险使得这种病毒感染的预防和治疗比其他病毒感染更难。蚊虫对病毒易感机制的研究,不仅可以阐明媒介效能的分子生物学机制,研究蚊媒病毒感染的免疫机制,同时也可为靶向调控甚至阻断病毒在蚊虫体内的复制和传播提供理论基础。本研究首先以埃及伊蚊（Aedes aegypti）Aag2细胞系和白纹伊蚊（Aedes albopictus）C6/36细胞系作为研究病毒感染蚊虫的模型,采用RNA测序（RNA sequencing,RNA-Seq）技术在Aag2和C6/36细胞感染DENV2前后的转录水平进行了测序。通过生物信息学分析筛选差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,并应用qRT-PCR对部分DEGs进行验证,并进一步分析其所参与的生物学功能。同时,结合前期研究中埃及伊蚊个体感染DENV2后中肠和唾液腺转录组的分析结果,挑选了部分DEGs在Aag2细胞系中构建过表达模型,验证基因与DENV2感染的相互作用机制。随后再对上述结果中影响DENV2复制的基因在感染和未感染的埃及伊蚊个体、组织样品中进行表达量的再次验证。本研究取得的主要结果包括:1.埃及伊蚊Aag2细胞感染DENV2前后的转录组测序分析共鉴定出1199个DEGs,其中185个上调、1014个下调。生物信息学分析显示,上调DEGs富集到39个通路,主要参与DNA复制、寿命调节、FoxO信号通路（forkhead box O）、嘧啶、视黄醇、药物、淀粉和蔗糖代谢等通路;下调DEGs富集到41个通路,主要参与寿命调节、昼夜节律、ABC转运子、光传导、MAPK信号通路（mitogen-activated protein kinase）、嘌呤、酪氨酸代谢等通路。12 个 DEGs 的qRT-PCR验证结果显示表达量倍数差异（fold change,FC）范围为1.05-1.43,其中3个基因感染后的表达量上调具有统计学意义（P<0.05）2.白纹伊蚊C6/36细胞感染DENV2前后的转录组测序分析共鉴定出1239个DEGs,其中1133个上调、106个下调。生物信息学分析显示,上调DEGs富集到82个通路,主要参与多种信号通路,包括MAPK、Hippo、FoxO、Wnt（wingless/integrated）、mTOR（mammalian target of rapamycin）和Notch 信号通路,甘油磷脂、半胱氨酸和蛋氨酸代谢途径,细胞生理过程,包括自噬、内吞和凋亡和其他过程,例如昼夜节律、mRNA监测途径、线粒体、RNA降解、泛素介导的蛋白水解和背腹轴形成等;下调DEGs富集到24个通路,主要参与DNA复制、嘧啶代谢、碱基切除修复、核苷酸切除修复、错配修复、药物代谢和叶酸生物合成等过程。13个DEGs的qRT-PCR验证结果显示表达量FC范围为0.84-6.41,其中8个基因感染后的表达量上调具有统计学意义（P<0.05）。3.Aag2和C6/36细胞转录组数据比较性结果显示共有16个DEGs重叠。GO富集分析显示,上调DEGs的富集结果包含7个重叠terms,主要包括含磷酸盐的化合物和磷的代谢过程,含核碱基的化合物、芳族化合物、杂环、有机环状化合物生物合成过程和DNA结合。下调DEGs的富集结果包含65个重叠的terms,主要参与芳香族化合物、含核碱基的化合物,细胞氮化合物,杂环,有机环化合物和有机物质分解代谢等通路。根据KEGG富集结果,上调DEGs富集到23条重叠通路,包括嘧啶代谢,长寿调节途径,药物代谢,淀粉和蔗糖代谢,FoxO信号传导途径和昼夜节律等通路。下调DEGs富集到8条重叠通路,分别是参与药物代谢,叶酸生物合成,Toll和Imd信号传导途径,缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸降解,剪接体,mRNA监测途径,嘌呤代谢和RNA转运。4.根据转录组和qRT-PCR验证结果,挑选出24个DEGs构建过表达模型,针对基因过表达后的Aag2细胞进行DENV2感染,其中有19个基因过表达后病毒拷贝数差异具有统计学意义（P<0.05）,表明这19个基因的表达影响DENV2在蚊虫细胞中的复制,会改变病毒载量。在感染后第2天（days post infection,dpi）,共有9个基因过表达后DENV2的RNA拷贝数相较于过表达EGFP（enhanced green fluorescent protein,增强型绿色荧光蛋白）对照组的差异具有统计学意义,FC在0.971-1.345之间。在4dpi,有10个基因过表达后DENV2的RNA拷贝数差异具有统计学意义,FC在0.657-1.574之间。在6dpi,也有9个基因过表达后DENV2 RNA拷贝数差异具有统计学意义,FC在0.551-1.095之间。再将这19个基因在感染和未感染DENV2的埃及伊蚊全蚊、中肠、唾液腺和卵巢中分别验证其表达量,这19个基因的表达量差异均有部分在不同组织间存在统计学意义（P<0.05）,表明这些基因与病毒复制存在着一定的相互作用。本文首次研究了埃及伊蚊Aag2细胞和白纹伊蚊C6/36细胞感染DENV2后在转录水平的变化,为挖掘伊蚊病原体易感相关基因提供了更快速有效的方法,同时为进一步研究媒介-病原相互作用的复杂机制提供了研究方向。通过Aag2细胞中相关基因过表达模型的构建和DENV2感染埃及伊蚊中基因表达量的检测,研究了基因与媒介蚊虫DENV2感染之间的相互作用,挖掘了一些参与病毒感染相关过程的靶标基因,为靶向调控蚊媒病毒感染和传播提供了理论依据。