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第一部分、电压门控质子通道Hv1在小鼠可卡因成瘾中的作用 目的:电压门控质子通道(voltage-gated proton channel,Hv1)特异性表达于小胶质细胞上,其主要功能是调节细胞内pH值,维持细胞内稳态并维持烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX),主要是NOX2的功能。有研究证明慢性可卡因暴露可导致脑内活性氧物质(reactive oxygen species,ROS)增加和氧化损伤,而阻断Hv1质子通道后可以减少病理情况下由小胶质细胞产生的ROS。因此,本部分主要研究Hv1在可卡因诱导的小鼠成瘾行为中的作用。 方法:用western blotting方法检测可卡因慢性暴露对奖赏行为相关脑区伏隔核区(nucleus accumbens,NAc)、内侧前额皮层(medial prefrontal cortex,mPFC)以及纹状体(striatum)中Hv1蛋白的表达以及对小胶质细胞激活的影响。运用行为学方法(条件性位置偏好),观察用Hvcn1短发夹核糖核酸(Hvcn1 shRNA)慢病毒载体沉默小鼠NAc区Hv1表达对可卡因诱导的条件性位置偏好的影响。 结果:Western blotting结果显示,可卡因腹腔注射对小鼠进行条件性位置偏好训练,成瘾小鼠NAc区Hv1表达明显增加,而mPFC和striatum区Hv1表达无明显改变。可卡因腹腔注射7天后,小鼠NAc区Hv1的表达明显增加,且小胶质细胞激活增加,表现为小胶质细胞标记物(ionized calcium binding adapter molecule1,Iba-1)表达上调。Hvcn1 shRNA慢病毒载体有效沉默小鼠NAc区Hv1蛋白。下调NAc区Hv1蛋白后对小鼠条件位置偏好无明显改善,但显著促进可卡因条件性位置偏好的消散。 结论:慢性可卡因暴露特异性引起小鼠NAc区Hv1表达增加,同时使NAc区小胶质细胞激活增加。Hvcn1 shRNA慢病毒载体有效沉默小鼠NAc区中的Hv1后,虽然对小鼠条件位置偏好无明显改善,但显著促进可卡因条件性位置偏好的消散,提示Hv1参与可卡因成瘾行为过程。 第二部分、电压门控质子通道Hv1参与小鼠可卡因成瘾的机制 目的:NOX是产生ROS的主要来源。脑内分布的NOX主要是NOX2,它参与氧化应激和神经炎症,在阿尔兹海默症和帕金森氏症等脑疾病中发挥着重要作用。现有的研究证实,慢性酒精暴露可引起NOX2亚单位gp91phox和ROS水平增加。考虑到慢性可卡因暴露导致Hv1表达上调以及NOX2与Hv1的激活密切相关,本部分主要探讨Hv1参与小鼠成瘾行为的机制是否与NOX2相关。 方法:用western blotting方法检测慢性可卡因暴露以及运用NOX2抑制剂夹竹桃麻素(apocynin)后,小鼠NAc区中NOX2亚单位gp91phox、p47phox、Hv1、Iba-1的蛋白表达情况。运用丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒检测慢性可卡因暴露以及给予apocynin干预后,小鼠NAc区脂质过氧化水平。采用行为敏化和条件性位置偏好两种行为学方法,观察腹腔注射apocynin对小鼠可卡因成瘾行为的影响。 结果:可卡因腹腔注射7天可引起小鼠NAc区NOX2亚单位gp91phox和p47phox的蛋白表达增加及该区脂质过氧化水平上升。给予apocynin减少由慢性可卡因暴露引起的小鼠NAc区p47phox表达增加,并降低该区脂质过氧化水平,但对gp91phox的影响不明显。给予apocynin减少由慢性可卡因暴露引起的小鼠NAc区小胶质细胞激活及Hv1蛋白表达增加。位置偏好实验显示,可卡因组小鼠对白色区表现出明显的位置偏好,而在给予可卡因前1h腹腔注射apocynin的小鼠对白色区的位置偏好明显减弱。行为敏化实验发现,腹腔注射apocynin7天组的小鼠的基础自发活动与腹腔注射生理盐水7天的对照组相比无显著性差别,提示apocynin不影响动物的基础运动状态。而相较于连续腹腔注射可卡因7天的小鼠,在给予可卡因前1h腹腔注射apocynin的小鼠自发活动明显减少。 结论:慢性可卡因暴露可引起小鼠NAc区NOX2激活,脂质过氧化水平增加。NOX抑制剂apocynin降低NAc区脂质过氧化水平,显著抑制由慢性可卡因暴露引起的条件性位置偏好和行为敏化。而apocynin抑制小胶质细胞激活、下调Hv1表达,提示Hv1在小鼠成瘾行为中的作用可能与NOX2密切相关。