蛋白激酶为蛋白质磷酸化过程的执行者,在复杂精密的细胞信号转导网络中常常作为调控节点而处于中心地位,其异常调控在多种类型肿瘤的发生发展中扮演重要角色。因此,蛋白激酶被作为重要的肿瘤治疗药物靶点。目前已有Gefitinib、Erlotinib和Sorafenib等一系列激酶抑制剂药物上市,而处于临床试验阶段的激酶类抑制剂疗法则超过130种,大多数已上市。激酶靶向药物的治疗效果受到广泛认可。然而,对此类药物的原发与继发性耐药性也难以避免。其中一个重要原因是对特定激酶及其底物间对应关系尚了解不够深入。因此,疾病相关信号通路中,明确参与调控的激酶类型是信号转导领域的热点问题之一,对于全面了解细胞信号转导分子机制、探究疾病机理、明确正确用药方案、缓解耐药性问题以及寻找新的药物靶点均具有重要意义。确定激酶与其底物对应关系的最直接有力的证据是蛋白质之间的物理相互作用。然而与其它酶与底物作用相似,与底物蛋白的相互作用为高度动态的过程,其结合与解离常发生在几十至几百毫秒级别。直接鉴定此类瞬时相互作用是信号转导领域的重大挑战之一。目前常用的蛋白质相互作用鉴定方法往往更适合较为稳定的蛋白质间相互作用(protein-protein interactions,PPIs),如亲和纯化-质谱法(affinity purification followed by mass spectrometry,AP/MS),由于常常需要花费数小时时间在高度稀释的液体环境富集特定蛋白质复合体,且需要多次对所得抗原-抗体复合物进行洗涤操作,使得不稳定或弱的蛋白质相互作用难以稳定保持。而基于免疫荧光等的技术虽然可用于观测蛋白质分子短时间内动态作用,却由于抗体种类与荧光通道有限等原因,难以实现同时对多个蛋白质分子间相互作用的稳定跟踪,同时也无法对未知相互作用进行鉴定。基于利用蛋白激酶趋向识别的氨基酸序列、共表达信息等的生物信息学算法对特定激酶可能的作用底物进行推测则由于准确性较低,只能作为辅助判断手段。化学交联法结合质谱鉴定是目前应用最为广泛的瞬时蛋白质相互作用分析技术。然而,由于甲醛等化学交联试剂缺乏特异性,常会造成大量假阳性结果,使结果分析缺乏准确性。针对以上问题,本研究初步发展了基于体内化学交联、定量质谱以及蛋白质相互作用动态学分析的研究策略,并以表皮生长因子受体(epidermal growth factor recrptor,EGFR)介导的信号复合体为研究模型,对参与EGFR信号复合体调控的激酶进行直接捕获及精准定量,实现了对特定复合体在信号转导过程中相关激酶的高可信度鉴定。实验结果发现包括酪氨酸激酶Lyn与Yes在内的多种潜在的EGFR信号复合体结合激酶,并通过时序性动态学分析,首次确定了在EGFR介导的信号传递过程中,STE20激酶家族成员GLK/MAP4K3特异性的存在于早期EGFR信号复合体中,提示MAP4K3为EGFR介导的信号通路中一种潜在的新型调控因子。此研究策略将可广泛应用于鉴定不同生理及病理条件下细胞内瞬时蛋白质相互作用。主要研究内容和结果如下:第一部分:EGFR介导的激酶信号通路时序性动态调控规律研究目的:由于前期研究中发现,信号转导的动态学特征具有细胞特异性,因此首先在模式细胞Hela细胞株中,对EGF刺激细胞后EGFR-Shc1信号复合体介导的信号通路中多个关键磷酸化位点激活过程的动力学进行分析。方法:1借助哺乳动物基因稳定表达技术,将外源性质粒Flag-GFP-p52Shc1WT-pCAGGS及Flag-GFP-pCAGGS转染人宫颈癌细胞Hela,并结合药物及流式细胞技术筛选并建立稳定表达Flag-GFP-Shc1融合蛋白(以下简称dt-Shc1)及Flag-GFP融合蛋白(以下简称GFP)的细胞株。2使用表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)(作用终浓度100ng/ml)分别于不同时间点刺激Hela GFP-Shc1细胞,刺激时长分别设置为0s、20s、40s、1min、2min、3min、5min、15min、20min、60min、120min、180min、360min,使用免疫印迹技术检测EGFR及Shc1蛋白不同磷酸化位点的活化程度随时间变化曲线,描绘EGF依赖的EGFR介导的信号通路在360min内的激活状态。结果:1.成功建立出Hela GFP和Hela dt-Shc1稳定株,并通过免疫印迹方法(immunoblotting,IB)对转入外源性蛋白的表达情况进行验证,表明稳定株可正确表达GFP及dt-Shc1蛋白。2.EGF依赖性的EGFR介导的信号通路主要涉及Ras-MAPK途径等,其中关键磷酸化激活位点在0~360min内活化程度由增强到衰减均呈现各自特有的变化趋势。第二部分:化学交联结合时序性动态分析鉴定EGFR-Shc1信号复合体直接相互作用激酶目的:优化基于多聚甲醛的活细胞体内化学交联条件,并发展化学交联-定量质谱以及蛋白质相互作用动态学分析相结合的研究策略,筛查潜在的EGFR-Shc1复合体相互作用因子,其中重点关注可与复合体直接相互作用的蛋白激酶。方法:1在Hela细胞裂解及免疫沉淀(immonoprecipitation,IP)前使用多聚甲醛溶液处理细胞,并优化交联条件。2化学交联结合非定量质谱技术鉴定及挑选EGFR-Shc1复合体的潜在相互作用蛋白。3将兴趣蛋白的PRM定量结果与第一部分研究中所描述的整体通路时序性激活曲线相比对,预测可能存在的相互作用因子。结果:1.利用免疫沉淀技术初步确定,对Hela细胞使用1%的多聚甲醛溶液(paraformaldehyde,PFA)室温反应20min为最佳反应条件。2.初步鉴定出了MAP4K3、MAP4K5、MAP4K4、Lyn和Yes等数个兴趣蛋白激酶。3.MAP4K3的定量结果在EGF刺激后0~360min内存在着极具规律性的变化,且与EGFR和Grb2定量结果存在一致性。结论:1.对蛋白质复合体中单个蛋白的时序动态学分析可以较为准确地展示信号转导过程中特定信号复合体中各个组成分子之间的上下游关系。2.本研究发展的化学交联-亲和纯化-定量质谱-动态学分析的研究策略可以应用于鉴定不同生理与病理状态下,或特定细胞信号转导过程中,细胞内各类瞬时蛋白质相互作用。3.利用此研究策略,首次鉴定了MAP4K3蛋白在Hela细胞中直接与EGFR-Shc1信号复合体发生物理相互作用,发现了一种EGFR的新型调控机制。MAP4K3在EGFR复合体中的生物学功能有待进一步研究。