研究背景:疾病的发生是多种因素综合作用的结果,以单靶点开发的西药往往局限于某一方面而疗效欠佳,中药的优势和特色则在于多靶同治。千百年来,我国传统医学以神农尝百草的方式创建了中药复杂体系网络综合作用的模式,这种模式也得到了西方医学的效仿,也逐渐采用多药联合的综合治疗。然而与西药相比,中药方剂最大的问题在于“盲法”治疗,药效物质不清,作用靶点不清,配伍的科学内涵不清,严重阻碍了中药的国际化进程。近年来有学者认为:中药复方中的有效成分组方应用能针对性的提高疗效,降低不良反应,将成为中药治疗指标的新模式。精简复方组成,摒弃不必要的多余成分,有利于促进中药内涵现代化。因此,寻找复方中的药效物质成分,利用分子生物学的分子靶点和检测技术,揭示中药方剂配伍的科学内涵,对传承和弘扬中医药精髓,促进其国际化进程具有十分重要的研究意义。中医理论认为“万病之恶在于瘀”。瘀阻在心,则诱发心肌缺血;瘀阻在肾,则造成肾脏缺血。心肌缺血的治疗往往继发性出现致死性再灌注,因此MI/R损伤日益受到高度关注。中医学家认为该病的病机为本虚标实,气血运行不利,瘀血内阻于心,历代医家主张采用“活血化瘀”的主要治则;肾脏缺血造成组织灌注不足,长期缺血导致CKI,在中医学将其归于癃闭、关格等范畴,血瘀兼证是最常见的证候,其病机特点为气滞血瘀、浊毒内生,因此传统中医药始终坚持以“活血化瘀、泄浊排毒”为主要治则。可见无论是MI/R,还是CKI,活血化瘀是根本治则。千百年来,传统中医药在血瘀导致的疾病治疗中发挥了十分重要的作用。丹参是传统的活血化瘀中药,与丹参配伍应用的对药有很多。例如丹参与红花配伍制成的现代中药复方制剂丹红注射液(danhong injection,DHI)主要用于心脑血管疾病的治疗。又如丹参与大黄配伍为主要成分的中药方剂和中成药有数十种(如:肾康注射液、肾衰宁胶囊、尿毒清颗粒等),主要用于慢性肾病的治疗。然而迄今,丹参对药配伍的科学内涵不清,对心肌保护或肾脏保护的分子作用机制不明,这严重阻碍了有效方剂的质量提升和二次开发。故阐明丹参对药配伍的药效物质及作用机制,对中药大品种质量提升、传承和弘扬中医药理论精髓、促进中医药现代化和国际化进程具有十分重要的科学研究意义。本研究以丹参-红花对药用于MI/R损伤和丹参-大黄对药用于CKI为切入点,寻找和验证其中的药效物质基础,阐明保护作用的分子机制,揭示对药作用的科学内涵,为中药复方药效物质和作用机制的研究提供参考。研究目的:第一部分:丹参-红花对药改善MI/R损伤的药效物质及作用机制1.筛选丹参和红花配伍制成的中药复方制剂DHI中发挥心肌保护的药效物质,并进行反馈验证。2.明确DHI及药效物质抗炎、抗氧化应激和抗凋亡的心肌保护作用。3.证实DHI及药效物质通过激活再灌注损伤补救激酶(reperfusion injury salvage kinase,RISK)信号通路发挥改善MI/R损伤的机制。第二部分:丹参-大黄对药改善CKI的药效物质及作用机制1.筛选丹参和大黄中发挥肾保护的药效物质,并进行反馈验证。2.明确丹参素和大黄酸联用抗纤维化、抗炎和抗凋亡的肾保护作用。3.探讨Sirt3/FOXO3a通路在丹参素和大黄酸联用发挥改善CKI的机制。研究方法:第一部分:丹参-红花对药改善MI/R损伤的药效物质及作用机制1.药效物质筛选:建立体外模拟缺血/再灌注(simulated ischemia/reperfusion,SI/R)损伤的心肌细胞模型,将丹参和红花中主要成分丹参素、丹酚酸A、丹酚酸B、原儿茶醛、迷迭香酸、羟基红花黄色素A、红花苷分别给予模型细胞,MTT法检测细胞存活率,ELISA法检测细胞CK-MB和LDH释放量,筛选丹参-红花配伍制成的DHI中发挥心肌保护作用的候选药效物质。2.候选药效物质反馈验证:将候选药效物质分别或组合给予MI/R损伤大鼠,监测心功能变化,Evans Blue和TTC双染法测定心肌梗死面积,ELISA法检测血清中CK-MB和c Tn I含量,H&E染色观察心肌组织损伤程度;将候选药效物质给予SI/R损伤原代培养的心肌细胞,再结合细胞存活率,以及释放的LDH活性,综合进行药效评价。3.抗炎作用:将药效物质及DHI分别给予MI/R损伤大鼠和SI/R损伤原代培养的心肌细胞,ELISA法检测大鼠血清和细胞上清中炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-10的含量,western blot法检测NF-kB通路相关蛋白表达情况,评价药效物质和DHI的抗炎作用。4.抗氧化应激作用:将药效物质及DHI分别给予MI/R损伤大鼠和SI/R损伤原代培养的心肌细胞,采用生化法检测MI/R损伤大鼠血清和SI/R损伤原代心肌细胞上清中MDA和SOD的水平,western blot法检测氧化应激通路转录因子Nrf2表达情况,评价药效物质和DHI的抗氧化应激作用。5.抗凋亡作用:将药效物质及DHI分别给予SI/R损伤原代培养的心肌细胞,流式细胞术和TUNEL染色法检测细胞的凋亡情况,ELISA法检测凋亡级联反应中最关键的效应酶Caspase-3的活性,评价药效物质和DHI的抗凋亡作用。6.激活RISK信号通路:将药效物质及DHI分别给予SI/R损伤原代培养的心肌细胞,同时给予PI3K抑制剂wortmannin和ERK1/2抑制剂U0126,western blot法检测PI3K/Akt和ERK1/2信号通路相关蛋白的表达,证实药效物质和DHI对RISK通路的激活。第二部分:丹参-大黄对药改善CKI的药效物质及作用机制1.药效物质筛选:建立体外转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)损伤HK-2细胞,将丹参和大黄中主要成分丹参素、丹酚酸A、丹酚酸B、原儿茶醛、迷迭香酸、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素分别给予模型细胞,MTT法检测细胞存活率,ELISA法检测细胞炎症相关因子TNF-α和IL-1β的释放量,再通过MTT法检测不同配比对细胞存活率的影响,筛选丹参-大黄对药中发挥肾保护作用的候选药效物质及最佳比例。2.候选药效物质反馈验证:建立大鼠5/6肾切除(5/6 nephrectomy,5/6Nx)模型模拟临床的CKI。将候选药效物质分别给予5/6Nx大鼠,监测动物体重和肾功(Scr和BUN)水平,16周后观察残存肾脏形态,超声造影检测肾脏血流供应情况,电镜观察肾组织超微结构的变化,综合进行药效评价。3.抗纤维化作用:将药效物质分别或组合给予5/6Nx大鼠,Masson染色和H&E染色观察残存肾组织的纤维化变性,统计肾小球硬化指数和肾小管损伤评分,免疫组化法检测纤维化标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)和α-SMA的表达,western blot法检测TGF-β/Smad3通路及其他纤维化相关蛋白的表达;将药效物质分别或组合给予TGF-β损伤的HK-2细胞,免疫荧光染色法检测E-cadherin和α-SMA的表达,评价药效物质的抗纤维化作用。4.抗炎作用:将药效物质分别或组合给予5/6Nx大鼠,RT-PCR法和ELISA法分别检测残存肾组织中TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6的m RNA水平和因子含量,western blot法检测炎症通路相关蛋白NF-kB、IkBα、ICAM-1和VCAM-1的表达,评价药效物质的抗炎作用。5.抗凋亡作用:将药效物质分别或组合给予5/6Nx大鼠和TGF-β损伤的HK-2细胞,TUNEL染色法分别检测残存肾组织和细胞的凋亡情况,western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达,评价药效物质的抗凋亡作用。6.激活Sirt3/FOXO3a通路:将药效物质分别或组合给予5/6Nx大鼠,免疫组化法检测肾组织中Sirt3和Ac-FOXO3a的表达,western blot法检测肾组织匀浆中Sirt3/FOXO3a通路相关蛋白的表达,评价药效物质对Sirt3/FOXO3a通路的激活作用。在HK-2细胞中转染Sirt3 si RNA,再次考察上述纤维化、炎症和凋亡指标的表达,验证Sirt3在药效物质发挥肾保护中的关键作用。研究结果:第一部分:丹参-红花对药改善MI/R损伤的药效物质及作用机制1.药效物质筛选:通过体外MTT实验和心肌酶检测,筛选出了DHI中的5种具有心肌保护作用的候选药效物质,分别为羟基红花黄色素A(A)、丹酚酸B(B)、丹参素(C)、原儿茶醛(D)和迷迭香酸(E)。2.候选药效物质反馈验证:在MI/R损伤大鼠中,DHI、A、B、C和5种单体的混合物均使大鼠各项心功能参数较MI/R组升高,心肌梗死面积减少,大鼠血清中CK-MB和c Tn I的含量降低,心肌组织病理损伤得到改善,而D和E则无明显变化,且5种单体的混合物与DHI的药效相当;在SI/R损伤心肌细胞中,DHI、A、B和C均使细胞存活率升高,LDH活性降低,能够减轻SI/R损伤程度,与体内实验结果一致,证实了A、B、C即为DHI中的药效物质。3.抗炎作用:无论在MI/R损伤大鼠血清或SI/R损伤心肌细胞上清中,A、B、C和DHI均能显著降低损伤后心肌细胞的IL-1β和TNF-α含量、升高IL-10水平,抑制炎症通路相关因子NF-κB的表达,且这种作用在应用了PI3K的抑制剂wortmannin或ERK的抑制剂U0126后消失。组间比较结果显示,A的抗炎作用优于B和C,与DHI相当。4.抗氧化应激作用:在MI/R损伤大鼠血清或SI/R损伤心肌细胞上清中,A、B、C和DHI均能显著降低损伤后心肌细胞的MDA含量、升高SOD水平,抑制氧化应激通路相关因子Nrf2的表达,应用wortmannin或U0126使这种作用消失。组间比较结果显示,B的抗氧化作用优于A和C,与DHI相当。5.抗凋亡作用:在SI/R损伤心肌细胞中,流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡结果均表明,A、B、C和DHI能显著降低细胞凋亡率,抑制Caspase-3的活性,应用wortmannin或U0126使这种作用消失。组间比较结果显示,C的体外抗凋亡作用略优于A和B,与DHI相当。6.激活RISK信号通路:western blot结果表明,给予A、B、C和DHI预处理均能使p-Akt和p-ERK1/2表达上调,与SI/R组相比具有极显著性差异。应用wortmannin或U0126后,这种作用被逆转,表明A、B、C和DHI通过激活RISK信号通路发挥作用。第二部分:丹参-大黄对药改善CKI的药效物质及作用机制1.药效物质筛选:通过体外MTT实验和炎症因子检测,筛选出了丹参-大黄中的2种具有肾保护作用的候选药效物质,分别为丹参素和大黄酸;通过检测两种单体不同配比对细胞存活率的影响,确定1:1配比的保护作用最强,与丹参-大黄配伍相当。2.候选药效物质反馈验证:在5/6Nx模型大鼠体内给药16周后,丹参素和大黄酸联用显著改善因部分肾切除造成的大鼠生长缓慢、肾功能损伤和肾组织超微结构改变,增加肾血流供应,具有明确的肾损伤保护作用,疗效显著优于单味药,证实了丹参素和大黄酸即为丹参-大黄对药中的药效物质。3.抗纤维化作用:在5/6Nx大鼠体内,丹参素和大黄酸联用显著改善肾纤维化程度,减轻病理损伤。进一步研究发现,其机制为抑制TGF-β/Smad3通路,增加肾脏纤维化的标志物E-cadherin的表达,降低α-SMA、Collagen-I和FN表达,两药合用的抗纤维化作用优于单味药。4.抗炎作用:在5/6Nx大鼠体内,丹参素和大黄酸联用显著抑制炎症反应,降低TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6的m RNAR水平和因子含量,其机制为抑制NF-?B通路及粘附分子相关蛋白的表达,两药合用的抗炎作用优于单味药。5.抗凋亡作用:在5/6Nx大鼠体内和TGF-β损伤的HK-2细胞中,丹参素和大黄酸联用显著降低TUNEL阳性染色率,抑制细胞凋亡。进一步研究发现,还能降低损伤的细胞中Bax和Caspase-3表达,增加Bcl-2表达,两药合用的抗凋亡作用优于单味药。6.激活Sirt3/FOXO3a通路:在5/6Nx大鼠中,丹参素和大黄酸联用可增加Sirt3表达,降低Ac-FOXO3a/FOXO3a的比值,激活Sirt3/FOXO3a通路;在Sirt3表达干扰的HK-2细胞中,丹参素和大黄酸联用增加E-cadherin表达、抑制α-SMA表达、阻断TGF-β/Smad3通路、减少炎症因子释放和抑制细胞凋亡的作用均消失,提示Sirt3在药物保护肾损伤中起着不可缺少的作用。研究结论:1.丹参和红花配伍制成的DHI中的主要药效物质为羟基红花黄色素A(A)、丹酚酸B(B)和丹参素(C)。2.三种药效物质和DHI具有明确的改善MI/R损伤的作用。3.三种药效物质和DHI能抑制炎症反应、氧化应激和细胞凋亡。4.三种药效物质和DHI通过激活RISK信号通路,保护MI/R损伤心肌。5.丹参和大黄对药中的主要药效物质为丹参素和大黄酸。6.丹参素和大黄酸联用具有明确的改善CKI的作用。7.丹参素和大黄酸联用能抑制肾脏纤维化、炎症反应和细胞凋亡。8.丹参素和大黄酸联用通过激活Sirt3/FOXO3a通路,改善CKI。