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随着糖生物学研究的开展，寡糖的重要生理活性和药用价值逐渐被人们所发现，而琼胶寡糖的抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用备受关注，有望成为新一代的海洋药物和功能食品。在琼胶寡糖制备方面，酶解法较其他方法有着底物专一性强、产物特异性高、反应条件温和等优点，有利于高纯度寡糖的大量制备。因此，高效琼胶酶的发现与规模化制备具有重要理论意义和明确的应用前景。本论文旨在建立两种高活力、高特异性的β-琼胶酶AgaA和AgaB大规模制备的技术平台，并利用这两种酶制备系列高纯度新琼寡糖。主要研究内容如下： 1．转基因菌株最佳产酶条件的建立 通过设计了L9（34）正交试验，从诱导温度、诱导时间、IPTG浓度、DOC浓度四个方面对产β-琼胶酶的转基因工程菌株BL21-pET24-agaA和BL21-pET24-agaB的表达条件分别进行了优化，最终确定BL21-pET24-agaA的最佳产酶条件为25℃，16 h，0.1 mM IPTG，0.01％ DOC，发酵液酶活性提高5.3倍；BL21-pET24-agaB的最佳产酶条件为25℃，24 h，0.1 mM IPTG，0.001％DOC发酵液酶活性提高近10倍。 2．琼胶酶的分离纯化 在优化了表达条件的基础上，利用快速蛋白质液相色谱纯化系统（FPLC）对两种β-琼胶酶分别进行了纯化。AgaA经过硫酸铵沉淀、疏水层析、凝胶过滤层析三步纯化，最终纯化342倍，活性回收率28.04％。AgaB经过硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析四步纯化，最终纯化476倍，活性回收率29.5％。经SDS-PAGE检验，纯化后的两种酶都己达到电泳纯。 3．系列高纯度新琼寡糖的制备 利用纯化的两种琼胶酶分别建立了高产不同聚合度新琼寡糖的最佳琼脂糖酶解体系。AgaA降解琼脂糖得到新琼寡糖的产率为74％，其中新琼四糖占47％，新琼六糖占45％；AgaB降解琼脂糖得到新琼寡糖的产率为81％，其中主产物新琼八糖占36%、新琼十糖32%、新琼十二糖16.7%。继而用分子筛Bio--Ge1P一2Fine和Bio一GelP一6 Fine对分子量范围不同的寡糖产物进行了纯化，使之纯度达到95%以上。纯度和聚合度用薄层层析（TLC）和荧光辅助碳水化合物电泳（FACE）进行了分析。 4.系列新琼寡糖的结构确证 在得到纯度较高单体的基础上，又利用基质辅助激光解吸一飞行时间质谱（撇LDITOF一MS）、红外光谱（IR）和核磁共振碳谱（‘3C一NMR）对系列新琼寡糖进行了结构的确证。MALDITOF书S结果均显示较强的〔M+Na]’及〔M+K]’金属分子离子峰，所得分子量分别为630（新琼四糖）、936（新琼六糖）、1242（新琼八糖）、1548（新琼十糖）和1854（新琼十二糖）。五种新琼寡糖的IR谱图的吸收峰数、位置和峰形基本相似，并与琼脂糖的图谱相似，表明琼胶酶在降解琼脂糖的同时，并没有对其结构产生重大的破坏作用。最后’3c一NMR结果中97 pPm和93pPm的化学位移作为还原端半乳糖c1位Q和p异头碳的特征峰，更证明了所得系列寡糖为新琼寡糖无疑。 本论文建立了两种p一琼胶酶的制备工艺，并利用这两种酶建立了系列高纯度新琼寡糖制备的技术平台，解决了新琼寡糖制备的技术难题，实现了系列高纯度新琼寡糖的大规模制备，为海洋寡糖类创新药物、功能食品等生物制品的研究与开发奠定了基础:并首次提供了新琼八糖、十糖和十二糖标准品，填补国际市场上的空白。