目的:本研究应用超高效液相色谱与串联四极杆飞行时间质谱仪联用技术,建立UPLC/Q-TOF-MSE方法在正、负离子全扫描模式下采集助孕丸健脾组方(由党参、黄芪、白术组成)的一级及多级质谱信息,较全面地对助孕丸健脾组方提取物的化学成分进行分析及鉴定,阐明了健脾组方的物质基础,并归属了主要色谱峰的中药材来源,为提高助孕丸健脾组方的质量控制标准提供化学依据;建立UPLC/Q-TOF-MS定量检测党参炔苷含量的快速、高效、准确的液质联用方法,并应用该液质联方法检测中药党参提取液及健脾组方提取液中党参炔苷的含量。以党参炔苷为代表性成分研究健脾组方在SD大鼠体内的的药代动力学过程,并与党参炔苷单体、中药党参中的党参炔苷的药代动力学过程进行比较,以探讨中药及组方中多种成分之间的相互作用关系,为中药配伍理论提供实验依据,也有助于助孕丸的药效学研究及临床应用。体外原代培养人早孕蜕膜细胞,应用米非司酮建立蜕膜细胞损伤模型,并考察健脾组方各组分对该模型的作用,探讨其可能的作用机理。方法:实验一助孕丸健脾组方物质基础分析:购买健脾组方中的道地药材党参、黄芪、白术并进行鉴定,采用冷凝回流提取的方法制备助孕丸健脾组方提取液。应用UPLC/Q-TOF-MSE技术,通过正、负离子全扫描的检测模式对健脾组方中的化学成分进行分析及鉴定。对于有标准品的化合物,通过Masslynx 4.1 software比对标准品的保留时间、精确质量数、同位素丰度和一级、多级质谱图的质谱裂解规律进行鉴定;对于无法获取标准品的化合物的检测,结合质谱图上给出的准分子离子峰,应用Masslynx系统软件推测其可能的化学组成,将该化合物质谱裂解规律与同类化合物的质谱裂解规律进行比较,结合参考文献资料后进行推测。并归属了主要的色谱峰的药材来源,对健脾组方进行了较全面地物质基础分析。实验二UPLC/Q-TOF-MS测定健脾组方及党参提取物中党参炔苷的含量:建立快速、高效地测定党参炔苷含量的UPLC/Q-TOF-MS方法,应用该方法测定党参提取液及健脾组方提取液中党参炔苷的含量。实验三基于UPLC/Q-TOF-MS技术党参炔苷药代动力学研究:以相同的党参炔苷灌胃量为标准,制备党参炔苷单体灌胃液、党参灌胃液及健脾组方灌胃液。将24只SPF级SD大鼠随机分为以上3组,每组8只。于灌胃后的5min、15min、30min、45min、60min、90min、120min、240min、480min、720min、1440min 进行眼眶取血约 0.5mL置于加有0.5%肝素的EP管内,常温下静置半小时。以3500r/min的转速离心15min。离心后取上次层血浆样品采用乙酸乙酯液液萃取的方法进行处理。应用UPLC/Q-TOF-MS技术检测不同时间点大鼠血浆中党参炔苷的含量并绘制药时曲线。应用PK.Solutions 2.0软件计算药代动力学参数:峰浓度(Cmax)、达峰时间(Tmax)、血药浓度-时间曲线下面积(AUC)、平均滞留时间(MRT)、总体清除率(CL)。比较党参炔苷以当党参炔苷单体形式、中药党参形式、健脾组方形式灌胃后其药代动力学差异。实验四蜕膜细胞的原代培养:采用复合酶(0.25%胰酶+0.1%Ⅰ型胶原蛋白酶)消化的方法消化分离人早孕蜕膜组织,原代培养蜕膜细胞,通过差时贴壁及传代自然增殖法纯化蜕膜细胞。经倒置光学显微镜、电子显微镜及免疫组化的方法对所培养的蜕膜细胞进行鉴定。实验五健脾组方中化学成分对蜕膜细胞损伤模型的影响:应用米非司酮(RU-486)建立蜕膜细胞损伤模型,观察助孕丸健脾组方各成分对蜕膜细胞损伤模型的作用。应用MTS法比较正常组,模型组、孕酮组和不同药物组细胞的增殖活力,应用AnnexinV-PI法流式检测各药物对蜕膜细胞损伤模型早期凋亡率的影响,采用Western Blot技术检测各组药物对蜕膜细胞损伤模型凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的表达影响,初步筛选出健脾组方中的药效成分。结果:实验一:完成了道地药材党参、黄芪、白术的鉴定。建立了分析助孕丸健脾组方UPLC/Q-TOF-MS的方法。得到了健脾组方及部分标准品在正、负离子模式下的一级和多级质谱图,对健脾组方中的主要成分(黄酮类、皂苷类、内酯类、糖苷类等)进行了质谱裂解规律分析。较全面地分析了健脾组方的化学成分,快速地表征了 37个色谱峰(误差范围为≤±5 ppm),并对这些色谱峰归属了药材来源。利用已知标准品鉴定了7个代表性化合物党参炔苷、黄芪甲苷、白术内酯Ⅰ、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷。实验二:建立了测定党参及健脾组方中党参炔苷含量的UPLC/Q-TOF-MS的方法,所建立的标准曲线r>0.999,在5-5000ng/mL的浓度范围内线性关系良好,且精密度、回收率等均符合要求。应用该方法测得中药党参和健脾组方中党参炔苷的含量分别为239.5μg/mL、87μg/mL。实验三:血浆样品中的党参炔苷在5-5000ng/mL的浓度范围内线性关系良好(r>0.990)。日内和日间精密度分别小于6.0%和5.0%,血浆样品中党参炔苷的回收率为70%,内标的回收率为70.0%以上。最低检测限为5ng/mL。应用药动学软件PK.Solutions 2.0计算出党参炔苷单体组、中药党参组、健脾组方组中党参炔苷的药代动力学参数分别为峰浓度 Cmax(ng/mL):138.59±28.65、127.61 ± 16.88、172.26±94.71;达峰时间 Tmax(hr):172.26±94.71、1.57±0.61、1.20±0.47;血药浓度-时间曲线下面积 AUC(Areang-hr/mL):176.61±20.59、551.07±83.26、737.57±127.97;平均滞留时间 MRT(areahr):2.27±1.80、4.46±1.86、5.37±1.94;总体清除率CL(mL/hr):6791.79±1785.45、2023.76±311.44、1559.73±334.67.比较三者峰浓度(Cmax)结果得知党参中的成分对党参炔苷单体的体内的达峰浓度无影响,而健脾组方中的成分可提高党参炔苷单体在体内的达峰浓度;比较三者达峰时间(Tmax)可知党参及健脾组方中的物质均可使党参炔苷单体在体内的达峰时间推后;比较三者血药浓度-时间曲线下面积(AUC)结果可知党参及健脾组方中的物质可提高党参炔苷单体在体内的生物利用度;比较三者平均滞留时间(MRT)结果可知党参及健脾组方中的物质可延长党参炔苷单体在体内的平均滞留时间。比较三者总体清除率(CL)结果可知党参及健脾组方中的物质可降低党参炔苷单体在体内的清除率。总体上讲党参及健脾组方中的物质有促进党参炔苷单体在体内的吸收,增加其生物利用度的作用。也为中药组方配伍提供了实验依据。实验四:采用复合酶消化的方法成功地完成了蜕膜细胞的原代培养,经倒置光学显微镜、电子显微镜、免疫荧光法(角蛋白为阳性,波形蛋白为阴性)综合鉴定所培养的细胞为蜕膜细胞;用差时贴壁及自然传代增殖法纯化后检测所培养细胞的分泌功能显示99%以上的细胞都有泌乳素蛋白的表达,表明所培养的蜕膜细胞纯度高。实验五:通过比较正常组与模型组细胞的增殖活力、早期凋亡率及凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的表达情况表明采用60μmol/L的米非司酮所造的蜕膜细胞损伤模型是成功的。健脾组方、党参炔苷、黄芪甲苷、白术内酯Ⅰ、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和孕酮对蜕膜细胞损伤模型都有不同程度的促进增殖,抑制凋亡的作用。结论:1.建立了液质联用分析健脾组方提取物药效物质基础的的方法,该方法快速、高效、精确,为提高助孕丸健脾组方的质量控制标准提供化学依据。并为黄酮类、皂苷类、内酯类、糖苷类等化合物的分析提供了质谱裂解规律的参考。2.应用UPLC/Q-TOF-MS的方法可快速、准确地测定中药党参及健脾组方中党参炔苷的含量。该方法的方法学考察结果精密度及回收率等均符合实验要求。为中药党参药材的质量控制提供了保障。3.建立了 UPLC/Q-TOF-MS测定大鼠血浆中党参炔苷含量的方法,采用的液液萃取的处理血浆样品的方法简便,快速,党参炔苷及内标连翘苷的回收率较高。进行方法学考察时,其专属性,线性关系、定量限、基质效应和稳定性等均符合实验要求。该方法可用于党参炔苷药代动力学的研究。经比较单体组、中药党参组及健脾组方组的药代动力学参数发现党参及健脾组方中的物质有促进党参炔苷的吸收,提高党参炔苷的生物利用度,延长党参炔苷在体内停留时间等作用。4.利用米非司酮(RU-486)建立的蜕膜细胞损伤模型筛选出了健脾组方中药效成分,健脾组方中的党参炔苷、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷等均对RU486蜕膜细胞损伤模型具有促进增殖的作用。健脾组方总提取物、孕酮亦有同样的作用。健脾组方及其中的化学成分对蜕膜细胞损伤模型有抑制早期凋亡率及凋亡蛋白表达的作用。从而推论其作用机制是通过促进损伤细胞增殖、抑制其凋亡实现的。