目的：　　我们推测在星形胶质细胞中氨通过Cav-1/PTEN/PI3K/AKT信号通路降低GSK-3β磷酸化水平使其活性增加。本实验主要探讨:①原代培养星形胶质细胞经氨慢性处理，对其Cav-1mRNA和蛋白表达变化的影响;②CD-1小鼠腹腔注射尿素酶，脑内Cav-1蛋白表达的变化;③原代培养星形胶质细胞经氨处理，对PTEN蛋白表达及AKT、ERK1/2、GSK-3β磷酸化水平的影响;④CD-1小鼠腹腔注射尿素酶，脑内PTEN蛋白表达变化及AKT、ERK1/2、GSK-3β磷酸化水平的变化;⑤GSK-3β抑制剂对原代培养星形胶质细胞在氨诱导下TRPC1表达的影响;⑥氨诱导原代培养星形胶质细胞及高血氨小鼠脑糖原含量的改变。　　方法：　　①原代星形胶质细胞培养成熟后，用RT-PCR方法检测3mM氯化铵处理3天对Cav-1mRNA表达的影响;用蛋白免疫印迹方法，检测1-5mM氯化铵处理3天或3mM氯化铵处理1-5天对Cav-1、PTEN蛋白表达和AKT、ERK1/2、GSK-3β磷酸化水平的影响;②CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，建立高血氨模型，用蛋白免疫印迹方法检测Cav-1、PTEN蛋白表达和AKT、ERK1/2、GSK-3β磷酸化水平变化;③成年FVB/NTg(GFAP-GFP)14Mes/J或者B6.Cg-Tg(Thy1-YFPH)2Jrs/J转基因小鼠腹腔注射尿素酶3天，建立高血氨模型，流式细胞分选出星形胶质细胞或神经元，用RT-PCR方法检测Cav-1mRNA表达变化;④利用蛋白免疫印迹方法，检测星形胶质细胞Cav-1基因沉默及预加入PTEN抑制剂bpv、MEK抑制剂U0126对氨诱导细胞内Cav-1蛋白表达及AKT、ERK1/2、GSK-3β磷酸化水平改变的影响;⑤利用蛋白免疫印迹方法，检测GSK-3β抑制剂Li2CO3对3mM氯化铵引起原代培养星形胶质细胞TRPC1表达改变的影响;⑥使用荧光检测方法，将培养成熟的原代星形胶质细胞用1-5mM氯化铵处理3天或3mM氯化铵处理1-5天，测定和分析糖原含量;CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，取脑组织测定和分析糖原含量;⑦使用GraphPad Prism5软件进行统计学分析，多组资料用one-way ANOVA方法进行比较，P＜0.05表示差异具有统计学意义。　　结果：　　1、氨诱导星形胶质细胞Cav-1mRNA及蛋白表达改变　　原代培养星形胶质细胞用3mM氯化铵处理3天，显著上调Cav-1mRNA表达;用1-5mM氯化铵处理3天，或用3mM氯化铵处理1-5天，结果表明3mM氯化铵作用3天显著上调Cav-1表达。CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，建立高血氨模型，结果表明尿素酶处理3天能够使Cav-1表达显著升高。　　2、氨诱导星形胶质细胞PTEN表达改变　　原代培养星形胶质细胞用3mM氯化铵处理3天以及CD-1小鼠腹腔注射尿素酶3天均可使PTEN表达显著上升。　　3、氨诱导星形胶质细胞AKT磷酸化水平改变　　原代培养星形胶质细胞用1-5mM氯化铵处理3天，或用3mM氯化铵处理1-5天，结果表明3mM氯化铵处理3天显著降低AKT磷酸化水平。CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，结果表明尿素酶处理3天能够使AKT磷酸化水平显著下降。　　4、氨诱导星形胶质细胞GSK-3β磷酸化水平改变　　原代培养星形胶质细胞用1-5mM氯化铵处理3天，或用3mM氯化铵处理1-5天，结果表明GSK-3β磷酸化水平在3mM氯化铵处理3天时降低最为显著。CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，结果表明GSK-3β磷酸化水平在尿素酶处理3天时降低最为明显。　　5、氨诱导星形胶质细胞ERK1/2磷酸化水平改变　　原代培养星形胶质细胞用1-5mM氯化铵处理3天，或用3mM氯化铵处理1-5天，结果表明氯化铵显著上调ERK1/2磷酸化水平。CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，建立高血氨模型，结果表明尿素酶处理3天时ERK1/2磷酸化水平显著升高。　　6、Cav-1基因沉默、PTEN抑制剂和MEK抑制剂对氨引起星形胶质细胞中信号通路蛋白表达改变的影响　　Cav-1基因沉默能够显著抑制氨诱导的AKT、GSK-3β磷酸化水平的降低和ERK1/2磷酸化水平的升高。　　将培养成熟的星形胶质细胞经3mM氯化铵慢性处理3天，在加入氯化铵前用PTEN抑制剂bpv预处理细胞，结果表明，氨引起的AKT、GSK-3β磷酸化水平的降低可被bpv抑制，bpv同时还可以促进ERK1/2磷酸化。　　MEK抑制剂U0126可抑制氨引起的GSK-3β磷酸化水平的降低。　　7、氨诱导星形胶质细胞TRPC1表达改变　　将培养成熟的星形胶质细胞经3mM氯化铵慢性处理3天，在加入氯化铵前用GSK-3β抑制剂Li+预处理细胞，结果表明氨引起TRPC1表达的升高可被Li+抑制。　　8、氨对星形胶质细胞及鼠脑中糖原含量的影响　　星形胶质细胞分别用1-5mM氯化铵处理3天或用3mM氯化铵分别处理1-5天，结果显示氯化铵能引起糖原含量显著下降。小鼠腹腔注射尿素酶(33units/kg/day)1-5天，结果表明尿素酶作用第3天和第4天时糖原含量明显下降。将培养成熟的星形胶质细胞经3mM氯化铵慢性处理3天，在加入氯化铵前用PTEN抑制剂bpv预处理细胞，实验结果表明氨引起的糖原水平降低可被bpv抑制。　　讨论：　　本实验明确了氨对糖原代谢过程中的干扰环节。实验结果显示氨慢性作用于星形胶质细胞时，首先引起Cav-1表达上调，导致细胞膜PTEN含量的增加，抑制了PI3K激活，失活的PI3K也抑制了AKT的活化，进而降低GSK-3β的磷酸化水平，使其活性增强，负性影响了GS的活性最终引起糖原含量下降，GSK-3β活性也同时影响了TRPC1的表达。糖原合成和糖原分解处于动态相互转化。当葡萄糖充足时，体内糖原合成加强，糖原分解减弱。尿素酶对CD-1小鼠脑组织糖原含量作用时间曲线可见对照组小鼠糖原含量每天变化无明显差异，是因为小鼠24小时内自由饮食，保证了葡萄糖的供给。当葡萄糖不足时，体内糖原分解加强，糖原合成减弱。氯化铵对原代培养星形胶质细胞糖原含量作用时间曲线中，对照组细胞糖原含量随着时间逐渐下降，其原因可能与细胞培养液中的葡萄糖随着时间增加持续消耗，引起糖原分解有关。　　在本研究中，慢性高血氨症可以通过增加Cav-1和PTEN的表达抑制PI3K/AKT信号通路最终使GSK-3β活性增强。因此GSK-3β活性增强对高血氨症的发生具有重要意义。我们之前报道过哇巴因抑制剂坎利酮不仅可以抑制氨诱导的细胞水肿及活性氧(ROS)的产生，而且也能抑制氨诱导的星形胶质细胞Ca2+增加、Cav1.2和TRPC1基因表达上调，因此我们推断抑制GSK-3β可能成为治疗高血氨症的一个新策略。　　结论：　　氨能影响Cav-1/PTEN/PI3K/AKT/GSK-3β和MAPK/ERK1/2信号通路相关蛋白的表达，MAPK/ERK1/2信号通路引起Cav-1/PTEN/PI3K/AKT通路下游因子GSK-3β活性增强，从而影响了TRPC1表达及糖原含量。