目的:SM22α是成熟血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表达的一种细胞骨架相关蛋白,在多种情况下作为衔接蛋白聚合信号复合物并调节信号转导。SM22α缺失可诱发血管炎症,促进NF-κB活化。腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是一种危害生命的慢性炎症性血管疾病,其形成与多种因素有关。研究显示,在动脉夹层组织和人AAA组织中SM22α丰度明显减少。然而,SM22α与动脉瘤发生之间的因果关系缺乏明确证据。本研究探讨缺失SM22α对腹主动脉瘤发生的影响及病理机制。方法:利用SM22α基因敲除和同窝野生型小鼠经背部皮下植入AngⅡI微渗透泵复制AAA模型,在整体水平评价SM22α与Ang Ⅱ诱导的AAA关系;用定量RT-PCR、Western blot技术和免疫荧光染色检测蛋白mRNA及蛋白质表达;用免疫荧光染色确定炎症部位促炎因子表达和炎性细胞的浸润;用间接共培养体系,确定VSMCs缺失SM22α活化巨噬细胞;用跨膜迁移分析和粘附分析确定VSMCs缺失SM22α对巨噬细胞迁移和粘附的影响;用细胞外分泌组学分析进一步阐明SM22α缺失在巨噬细胞与VSMCs粘附中的作用机制;利用抗体阻断实验,确定SM22α缺失增加巨噬细胞活化、迁移和粘附是通过上调VCAM-1实现的;用免疫共沉淀分析和免疫双荧光染色,确定F-actin和VCAM-1具有相互作用,并明确其相互作用发生在皮层区。结果:1 SM22α缺陷促进腹主动脉瘤形成1.1SM22α缺失有助于Ang Ⅱ诱导腹主动脉瘤形成对腹部主动脉瘤模型分析结果显示,输注Ang Ⅱ的Sm22α-/-小鼠和Sm22α+/+小鼠在腹主动脉部位均有动脉瘤形成,发病率分别为66.7%(10/15)和26.7%(4/15),Sm22α-/-小鼠AAA发病率明显高于Sm22α+/+小鼠(P<0.05)。小动物超声活体测量腹主动脉直径显示,Sm22α-/-小鼠的腹主动脉最大直径显著高于Sm22α+/+小鼠(P<0.01)。结果表明,SM22α缺失促进Ang Ⅱ诱导AAA形成。1.2SM22α缺失促进MMP-2、MMP-9释放,弹力纤维和胶原蛋白降解植泵28天剥取腹主动脉进行组织包埋,取Sm22α-/-小鼠腹部动脉瘤部位和Sm22α+/+小鼠相等部位切片,对组织切片进行HE、EVG和免疫荧光染色,结果显示,Sm22α-/-小鼠腹主动脉瘤部位管腔膨胀,管壁增厚,弹力纤维断裂和胶原蛋白降解,病变程度比Sm22α+/+小鼠更为明显。定量RT-PCR、Western blot和组织免疫荧光染色检测MMP-2和MMP-9表达,结果显示,与生理盐水对照组相比,Ang Ⅱ促进小鼠腹主动脉组织MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表达;而Sm22α-/-小鼠腹主动脉MMP-2和MMP-9表达明显高于Sm22α+/+小鼠。结果表明,SM22α缺失促进Ang Ⅱ诱导的MMP-2和MMP-9表达,导致血管细胞外基质降解,管壁结构重塑。1.3SM22α缺失导致的腹主动脉瘤是血压非依赖的为了验证Sm22α-/-小鼠AAA的形成是否与高血压有关,通过智能无创血压计监测小鼠血压变化,结果显示,与对照组相比,两种基因型小鼠注入Ang Ⅱ第1周血升压开始明显升高,直至第4周血压持续升高,但第3周和第4周Sm22α-/-小鼠的血压升高明显低于Sm22α+/+小鼠(P<0.001),表明Sm22α-/小鼠增加的AAA发生率不依赖于AngⅡ诱发的高血压。2敲除SM22α促进血管中膜巨噬细胞浸润和活化2.1SM22α缺失增加血管炎症对组织切片进行免疫荧光染色,结果显示,在Ang Ⅱ作用下,大量巨噬细胞聚集在Sm22α-/-小鼠中膜。主动脉组织定量RT-PCR检测结果显示,在Ang Ⅱ作用下,两种基因型小鼠腹主动脉组织中促炎因子IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α、VCAM-1 和 ICAM-1 的 mRNA 表达上调,而Sm22α-/-小鼠促炎因子的表达明显高于Sm22α+/+小鼠(P<0.001)。以上结果表明,SM22α缺失是通过增加巨噬细胞浸润和促炎因子释放增强炎症反应促进AAA发生。2.2SM22α缺失促进巨噬细胞募集为了进一步探讨SM22α缺失是否直接影响巨噬细胞的聚集,通过VSMCs-RAW264.7细胞共培养系统,检测敲除SM22α对巨噬细胞跨膜迁移和粘附的影响。跨膜迁移和粘附分析结果显示,在Ang Ⅱ作用下,RAW264.7细胞的跨膜迁移增强,同时与VSMCs粘附的数量增多,而与野生型VSMCs相比,SM22α缺失明显增加RAW264.7细胞的跨膜迁移和(P<0.001)与VSMCs粘附能力(P<0.01);然而,当Sm22α-/-小鼠VSMCs恢复SM22α表达后明显降低对RAW264.7细胞跨膜迁移(P<0.001)和与VSMCs粘附的促进作用(P<0.01)。以上结果表明,SM22α缺失通过直接影响巨噬细胞的迁移和粘附,促使巨噬细胞募集。2.3SM22α缺失促进巨噬细胞活化用AngⅡ刺激Sm22α-/-和Sm22α+/+小鼠VSMCs后,收集细胞培养基。定量RT-PCR检测结果显示,与野生型相比,Sm22α-/-小鼠VSMCs条件培养基明显促进RAW264.7细胞表达促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1(P<0.001),诱导巨噬细胞活化。然而,当Sm22α-/-小鼠VSMCs恢复SM22α表达后,则对巨噬细胞的活化能力降低。结果表明,缺失SM22α的VSMCs可激活巨噬细胞表达促炎因子。3 SM22α缺失促进血管平滑肌细胞VCAM-1表达3.1血管平滑肌细胞外分泌组学分析对VSMCs培养基进行外分泌蛋白质组学分析,结果显示,在外分泌差异蛋白中,Sm22α-/-来源的可溶性VCAM-1(sVCAM-1)的表达是野生型的25.6倍,是差异最显著的一种粘附分子。3.2敲除SM22α促进VCAM-1表达VCAM-1在单核细胞浸润过程中发挥重要作用。对两种基因型小鼠的主动脉组织分别进行Western blot和免疫荧光染色,结果显示,在Ang Ⅱ植泵的Sm22α-/-小鼠主动脉中VCAM-1表达明显高于野生型小鼠。对体外培养的VSMCs培养基和膜蛋白进行分析,结果显示,与野生型VSMCs相比,缺失SM22α促进Ang Ⅱ诱导的VCAM-1表达,细胞膜表面VCAM-1和sVCAM-1表达同时升高(P<0.001)。然而,补救表达SM22α的细胞其VCAM-1表达明显受到抑制,细胞膜表面VCAM-1和sVCAM-1明显减少(P<0.05)。结果表明,SM22α对VCAM-1表达具有负调节作用。3.3SM22α缺失通过上调VCAM-1介导巨噬细胞募集为了进一步明确VCAM-1在巨噬细胞浸润中的功能,收集Ang Ⅱ刺激的Sm22α-/-小鼠细胞培养基,用抗VCAM-1抗体中和培养基中的sVCAM-1,观察其对RAW264.7细胞的影响。结果显示,中和培养基sVCAM-1后,其诱导的RAW264.7细胞跨膜迁移明显减少(P<0.001),RAW264.7 细胞中 TNF-α、MCP-1、IL-1β 和 IL-6 mRNA 表达明显下降。为了验证上述发现,用重组VCAM-1处理RAW264.7细胞,结果显示,VCAM-1可明显增加RAW264.7细胞迁移和活化。此外,用抗VCAM-1抗体阻断VSMCs膜表面的VCAM-1后,观察其与RAW264.7细胞的相互作用。粘附分析显示,两种细胞的粘附明显减少(P<0.01)。结果表明,SM22α缺失的VSMCs通过上调VCAM-1实现对巨噬细胞的募集和活化。3.4敲除SM22α促进皮层F-actin与VCAM-1的结合和VCAM-1膜定位已知SM22α参与actin细胞骨架重构,下调SM22α可促进胞浆F-actin解聚和皮层区F-actin聚合。为了探讨actin细胞骨架动力学是否参与VCAM-1细胞膜转位,通过免疫共沉淀检测二者的相互作用。结果显示,SM22α缺失促进细胞VCAM-1与F-actin的相互作用。双荧光染色细胞骨架和VCAM-1,结果显示,VCAM-1与皮层区F-actin共定位。用细胞骨架稳定剂JPK预处理VSMCs后,F-actin与VCAM-1相互作用减弱,皮层区共定位明显减少。表明SM22α缺失通过调节actin细胞骨架动力学而促进VCAM-1膜定位。结论:1 SM22α缺陷促进腹主动脉瘤形成。2 敲除SM22α促进血管中膜巨噬细胞浸润和活化。3 SM22α缺失促进血管平滑肌细胞VCAM-1表达。