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第一部分小胶质细胞P2X4受体对慢性偏头痛中枢敏化的影响目的偏头痛慢性化的病理生理机制不清楚。该部分研究用于探索小胶质细胞P2X4受体在反复硝酸甘油(Nitroglycerin,NTG)刺激诱导的慢性偏头痛小鼠中枢敏化中的作用,为慢性偏头痛的治疗提供新的方向。材料与方法1.通过隔日腹腔注射10mg/kg NTG构建慢性偏头痛小鼠模型,持续9天,总共5次(即第1,3,5,7,9天是给药时间)。于每次给药前及给药后2小时用电子von Frey纤维丝检测小鼠后肢足底的机械性痛阈值。给药前的痛阈值为基础痛阈值,给药后的阈值为急性痛阈值。同时检测小鼠三叉神经脊束核尾侧亚核(TNC)部位P2X4受体的表达变化趋势及小胶质细胞标志物Iba1的数量及形态改变。2.通过腹腔注射P2X4受体特异性抑制剂5-BDBD观察模型小鼠后肢痛阈值的变化及TNC部位与中枢敏化相关指标的变化,如磷酸化-细胞外调节激酶(p-ERK),c-Fos和降钙素基因相关肽(CGRP)的表达水平。3.模拟NTG的给药方式,腹腔隔日注射P2X4受体激动剂IVM(0.1mg/kg,1mg/kg)。在实验的第1,3,5,7,9天,每次IVM给药前检测小鼠后肢足底机械性和热痛阈值;同时检测TNC部位p-ERK,c-Fos,CGRP的表达变化。结果1.反复NTG刺激后,模型小鼠TNC部位小胶质细胞激活,表现为Iba1免疫荧光阳性细胞数目增多(p<0.05),Iba1荧光面积增加(p<0.05)。小胶质细胞数目增多、体积增大,但仍然呈分支状。同时给予小胶质细胞抑制剂米诺环素(MC)可以抑制小胶质细胞的激活,也可以抑制NTG诱导的小鼠基础机械性痛阈值的降低(p<0.05),但是对急性痛觉过敏没有改善作用。2.反复NTG刺激后,模型小鼠TNC部位P2X4受体的mRNA和蛋白表达水平增多(p<0.05);免疫荧光结果显示P2X4受体主要与小胶质细胞共定位。给予P2X4受体的抑制剂5-BDBD可以提高反复NTG刺激诱导的小鼠后肢撤退阈值(PWT)和撤退潜伏期(PWL)的降低,改善机械性和热痛觉过敏(p<0.05)。同时5-BDBD治疗抑制NTG诱导的TNC部位p-ERK,c-Fos的激活和CGRP的释放。3.通过高剂量IVM反复激动P2X4受体可以降低PWT和PWL,诱导小鼠后肢出现机械性和热痛觉过敏(p<0.05)。低剂量IVM仅可以诱导小鼠出现可逆的机械性痛觉过敏,对热痛阈值没有改变。另外反复高剂量IVM刺激可以诱导小鼠TNC部位p-ERK,c-Fos的激活,促进CGRP释放。结论该部分研究显示偏头痛慢性化的过程中伴随着小胶质细胞的激活及P2X4受体的表达增多,抑制小胶质细胞激活或者P2X4受体功能可以抑制小鼠痛觉过敏的产生,以及偏头痛中枢敏化相关指标的变化。因此,小胶质细胞P2X4受体可能参与了偏头痛的慢性化,调节P2X4受体的功能可能是潜在的治疗策略。第二部分P2X4受体通过激活p38MAPK介导小胶质细胞BDNF的合成和释放目的探究小胶质细胞P2X4受体激活对BDNF合成及释放的影响及其可能的细胞内信号通路,进而研究P2X4受体参与慢性偏头痛的病理生理机制。材料与方法1.体外培养小胶质细胞系BV2细胞,给予50uM ATP刺激,在30min,60min,120min,180min不同时间点,检测细胞内及上清液中BDNF的含量变化,同时找到BDNF合成及释放的最大时间点,以此作为后续实验的依据。2.在ATP刺激BV2细胞前15min给予P2X4受体特异性抑制剂5-BDBD(20uM)干预,检测细胞内及上清液中BDNF的含量变化。3.检测细胞内p38-MAPK,p-p38的含量变化;给予p38-MAPK抑制剂SB203580(10μM)后检测细胞上清液中BDNF含量的变化。结果1.WB结果显示,ATP作用60min后BV2细胞内BDNF合成增加,在120min时达到高峰。在监测的最后时间点180min时仍然维持较高的水平(p<0.05)。ELISA结果显示,BV2细胞释放BDNF在ATP刺激的60min时明显增加,120min时达到高峰(p<0.05),这和细胞内合成BDNF的变化趋势一致。2.5-BDBD可以抑制ATP诱导的BV2细胞内BDNF的合成(p<0.05),同时也可以抑制ATP诱导的BDNF的释放(p<0.05)。单独使用5-BDBD并不会影响细胞内BDNF的合成和释放。3.WB结果显示,ATP 50μM作用细胞2h后,可以激活p38-MAPK,导致其磷酸化蛋白p-p38显著增加(p<0.05),但是总p38-MAPK的表达没有变化。给予P2X4受体特异性抑制剂5-BDBD后可以抑制p38-MAPK的磷酸化(p<0.05)。单独使用5-BDBD,并不会激活p38-MAPK。p38-MAPK的抑制剂SB203580可以抑制ATP诱导的BDNF的释放(p<0.05),也可以减少细胞内BDNF的合成。结论ATP刺激P2X4受体导致依赖于p38-MAPK激活的BDNF的释放和合成增加。BDNF可能是介导小胶质细胞(microglia)和神经元(Neuron)进行cross-talk的关键分子。针对小胶质细胞的P2X4R-p38MAPK-BDNF信号通路可能有助于开发治疗偏头痛慢性化的新方法。第三部分BDNF对慢性偏头痛小鼠中枢敏化的影响目的体内实验探究BDNF对反复NTG诱导的慢性偏头痛小鼠中枢敏化的影响,进一步验证P2X4受体-p38MAPK-BDNF通路在偏头痛慢性化中的作用。材料与方法1.通过隔日腹腔注射NTG构建慢性偏头痛模型,在实验的第3,5,7,9天检测小鼠TNC部位p38-MAPK,p-p38-MAPK,BDNF的蛋白水平。另外使用免疫荧光技术观察BDNF的细胞定位情况。2.给予P2X4受体抑制剂5-BDBD治疗,检测p38-MAPK,p-p38,BDNF的表达变化。另一方面,隔日间断给予IVM(0.1mg/kg,1mg/kg)反复激活P2X4受体,检测P2X4受体,p38-MAPK,p-p38,BDNF的表达变化。3.给予BDNF受体TrkB特异性抑制剂ANA-12(1mg/kg),检测小鼠后肢足底的机械性痛阈值和热痛阈值的变化,以及检测小鼠TNC部位p-ERK及c-Fos的激活,CGRP的释放变化。结果1.反复NTG刺激可以显著增加BDNF蛋白的表达。这种上升趋势从第5天开始一直可以持续到最后一次给药(p<0.05),另外,反复NTG刺激并不会增加TNC部位p38-MAPK蛋白的表达,但会增加p-p38的表达(p<0.05)。这种增加趋势在第5天开始出现,第9天仍然明显。2.在NTG给药的第9天,模型组TNC部位BDNF免疫荧光反应增强,表达增加,且大部分与Iba1共定位;也有少量BDNF与神经元共定位。3.通过5-BDBD阻断P2X4受体可以抑制反复NTG刺激导致的p38-MAPK磷酸化的增加和BDNF的合成。而通过IVM反复激活P2X4受体,不仅可以增加P2X4受体的表达,还可以增加p-p38,BDNF的表达(P<0.05),对p38-MAPK没有影响。4.ANA-12治疗可以抑制NTG导致的小鼠后肢撤退阈值(PWT)和后肢撤退潜伏期(PWL)的降低(p<0.05),抑制机械性痛觉过敏和热痛觉过敏的产生。然而单独使用ANA-12并不会影响小鼠的痛阈值。免疫荧光结果显示ANA-12抑制NTG诱导的CGRP释放和c-Fos的激活(p<0.05)。WB结果显示ANA-12治疗可以抑制NTG诱导的p-ERK磷酸化(p<0.05)。结论P2X4受体可以影响小胶质细胞BDNF的合成及释放,BDNF通过作用于神经元上的TrkB受体,实现Neuron-microglia信号交流,通过抑制CGRP释放,ERK磷酸化,c-Fos的激活,从而影响慢性偏头痛中枢敏化的产生,避免痛觉过敏产生。