论文部分内容阅读
目的：原核表达细胞穿膜肽pep-1和病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ（viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)的融合蛋白pep-1-vMIP-II，并检测该融合蛋白是否具有穿透细胞膜从而发挥激活多种抗HIV-1基因表达上调的功能。为vMIP-II发展成为一种新型的、易于给药的防治艾滋病新药提供基础数据。
方法：以KSHV基因组为模板，PCR扩增出vMIP-II的开放阅读框。将化学合成的细胞穿膜肽pep-1和vMIP-II基因克隆入原核表达载体pET15b，构建原核表达载体的pET15b-pep-1-vMIP-II质粒和对照载体pET15b-vMIP-II。重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3)plysS，IPTG诱导，SDS-PAGE和Western-blot鉴定表达产物，Ni-NTA琼脂亲和层析纯化回收目的蛋白。分别取10μg/mL的融合蛋白pep-1-vMIP-II和不含穿膜肽序列的对照组蛋白vMIP-II处理Hela细胞，激光共聚焦显微镜观察该融合蛋白的穿膜功能。以200nmol/l的融合蛋白和对照蛋白同时分别处理HMEC-1细胞和Jurkat细胞，收集细胞，抽提总RNA，荧光定量PCR检测抗HIV基因（MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F）的表达情况。
结果：成功构建了原核表达载体pET15b-pep-1- vMIP-Ⅱ和pET15b-vMIP-II，DNA序列比对分析表明表达载体具有正确的序列和阅读框。表达并纯化出可溶性pep-1- vMIP-Ⅱ融合蛋白及vMIP-Ⅱ蛋白。激光共聚焦显微镜观察结果显示：融合蛋白pep-1-vMIP-II能穿透细胞膜进入细胞核内，vMIP-Ⅱ蛋白不能进入细胞核内。荧光定量PCR结果显示：融合蛋白pep-1-vMIP-II能使Jurkat细胞中抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分别上调3.36、2.21、1.40、2.09、2.72倍；使HMEC-1细胞抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分别上调57.80、158.63、97.29、2.18、2.43倍。vMIP-II蛋白能使Jurkat细胞中抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分别上调9.70、22.03、1.59、1.79、1.85倍；使HMEC-1细胞抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分别上调57.77、159.66、108.77、2.36、2.31倍。两种蛋白在Jurkat和HMEC-1细胞中上调ARGS的表达的功能无显著差异。
结论：成功在大肠杆菌中诱导表达出融合蛋白pep-1-vMIP-II，融合蛋白pep-1-vMIP-II能够穿透细胞膜进入细胞核内，pep-1-vMIP-II与vMIP-II蛋白激活多种抗HIV-1基因表达功能无显著差异。