研究背景破骨细胞(osteoclasts, OCs)介导的骨吸收与成骨细胞(osteoblasts, OBs)介导的骨生成达到平衡维持骨代谢稳态。然而,当失去平衡则可能发生骨骼疾病。破骨细胞是体内唯一具备骨吸收功能的细胞,过度激活将引起骨质过度吸收,造成骨破坏,导致骨质疏松(osteoporosis, OP)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)、骨关节炎(osteoarthritis, OA)等常见关节疾病。目前用于治疗这些疾病的药物主要有糖皮质激素类或非甾体类抗炎药、抗生素和免疫抑制剂等。然而,它们不能改善骨破坏,或会引起子宫癌、卵巢癌和乳腺癌等不良反应和增加心血管疾病的风险,一些传统抗炎药物如地塞米松、甲氨喋呤(Methotrexate, MTX)等反而能促进破骨细胞形成或促进骨破坏。靶向抑制破骨细胞的制剂,成为一类能够治疗破骨细胞过度激活引发骨破坏、并减轻相关疾病痛苦的药物。破骨细胞由造血巨噬细胞／单核细胞谱系前体细胞分化,其经历了前体细胞的增殖、分化融合和激活过程。RANKL和M-CSF (macrophage-colony stimμlating factor,巨噬细胞集落刺激因子)是破骨细胞生成的必需因子。在破骨细胞的生成过程中,RANKL与受体RANK(激活核因子NF-κB受体,receptor activation of nuclear factor NF-κB)结合,募集并激活衔接分子TRAF6,激活蛋白激酶MAPK(ERK、JNK和p38)和转录因子NF-κB、AP-1和NFAT,这些转录因子的活化上调破骨细胞相关基因,从而调节破骨细胞的分化。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是G-菌细胞壁的主要成分,是众所周知的导致炎症性骨丢失的病原体,并且是第一个在体外有能力诱导骨吸收的细菌成分。LPS引起的骨丢失与其诱导破骨细胞分化与活化有关,其机制包括：LPS通过增强RANK信号和COX-2表达促进破骨细胞的分化和活化；LPS可通过刺激TNF-α在内的细胞因子产生后诱导具有骨吸收活性的破骨细胞的分化与活化；或直接促进破骨细胞的分化、融合、生存和活化。青蒿琥酯(artesunate, Art)为中药青蒿有效成分青蒿素的半合成衍生物,是临床治疗恶性疟最有效、低毒的药物之一,近年表现出越来越多的抗炎免疫抑制作用。青蒿琥酯可抑制NF-κB、IκB、TNF-α,IL-6和Th反应等改善结肠炎,脓毒血症；抑制II型胶原诱导的大鼠关节炎或佐剂性关节炎,抑制胶原诱导关节炎的骨质疏松。上述疾病中,有很多疾病属于“骨免疫学”范畴下破骨细胞过度活化、骨质破坏明显升高的疾病。但是,该药能否影响破骨细胞生成未有研究报道,能否通过抑制破骨细胞改善“骨免疫学”范畴下破骨细胞相关骨破坏疾病未见报道。本文将建立RANKL和LPS诱导破骨细胞的体外培养体系和体内去卵巢骨质疏松动物模型和LPS诱导的急性骨破坏动物模型,探讨青蒿琥酯对破骨细胞的作用及其分子机制。本研究主要包括三部分内容：1.青蒿琥酯对RANKL诱导的破骨细胞及小鼠去卵巢骨质疏松的影响；2.青蒿琥酯对RANKL诱导的破骨细胞作用机制；3.青蒿琥酯对LPS诱导的破骨细胞及小鼠急性骨破坏的影响和作用机制。实验方法1.通过MTT法考察3.125、6.25和12.5 μM青蒿琥酯于8 h、24 h、48 h、7 d对RAW264.7细胞的毒性,以确定其体外实验浓度。利用RAW264.7细胞和骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)两种细胞建立体外RANKL诱导的破骨细胞培养体系,通过TRAP染色法考察3.125、6.25和12.5 μM青蒿琥酯对RANKL诱导RAW264.7细胞和BMMs转化成破骨细胞的影响并以Real-time PCR检测破骨细胞相关基因c-Src、Fra-2、RAP、β3-Integrin、Cathepsin K、MMP-9、DC-STAMP和Atp6v0d2等mRNA表达水平进行验证,以验证青蒿琥酯对破骨细胞生成和骨吸收功能的影响。利用Osteo Assay Surface 96-well Plate板通过骨吸收陷窝实验评价3.125、6.25和12.5μL浓度的青蒿琥酯对RANKL诱导的破骨细胞破骨活性的影响。建立去卵巢骨质疏松小鼠骨破坏模型,以唑来膦酸作为阳性对照药,通过考察青蒿琥酯对模型小鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Sp等骨参数及小鼠血清RANKL、OPG、TRAP-5b和ALP等相关细胞因子等指标的影响,体内评价青蒿琥酯对破骨细胞相关的小鼠骨破坏的影响。2.青蒿琥酯抑制RANKL诱导的破骨细胞生成的作用机制。首先采用Real-time PCR、Western blot和荧光素酶报道基因技术,分别检测NFATc1转录基因的mRNA、NFATc1蛋白和荧光素酶报道基因表达水平变化,从三个不同侧面考察青蒿琥酯对核转录因子NFATc1活化的影响。Western blot检测青蒿琥酯对RANKL诱导的NFATc1信号通路上游蛋白钙调磷酸酶表达的影响。通过以Fluo-3/AM作为Ca2+探针的confocal技术考察青蒿琥酯对200s内RANKL诱导的细胞内Ca2+浓度变化的影响。利用Western blot技术检测青蒿琥酯对RANKL诱导的PLCγ1磷酸化的影响。通过Real-time PCR和Western blot技术检测青蒿琥酯对RANKL/RANK信号通路上游信号分子RANK、TRAF6表达的影响。最后通过荧光素酶报道基因技术检测RANKL刺激RAW264.7细胞NF-κB报告基因表达变化,以考察青蒿琥酯对NF-κB转录活性的影响。3.建立体外LPS诱导RAW264.7细胞的破骨细胞培养体系,通过TRAP染色法考察青蒿琥酯在3.125、6.25和12.5μL浓度下对LPS诱导RAW264.7细胞转化成破骨细胞的影响；采用Real-time PCR技术,检测3.125μM和12.5μL浓度的青蒿琥酯对LPS诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞转化过程中破骨细胞相关因子Fra-2、TRAP、β3-Integrin、Cathepsin K、DC-STAMP和Atp6v0d2等mRNA表达水平的影响,以进一步证实青蒿琥酯对破骨细胞生成的影响。通过ELISA技术检测不同浓度的青蒿琥酯(3.125、6.25和12.5μM)对体外LPS诱导RAW264.7细胞释放TNF-a的影响。建立LPS诱导的小鼠急性骨破坏模型：分别于第0d和第4d腹腔注射LPS 5 mg/kg建立模型,腹腔注射青蒿琥酯10mg/kg/d进行药物干预,共8 d。通过考察对模型动物骨参数(骨矿物质密度、骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁分离度)及血清中TNF-a等指标的影响,评价青蒿琥酯对炎症性骨破坏的影响。青蒿琥酯对LPS诱导破骨细胞生成的作用机制研究。在体外LPS诱导RAW264.7细胞体系中,首先采用Real-time PCR、Western blot和荧光素酶报道基因技术,分别检测NFATc1转录基因的mRNA、NFATc1蛋白和荧光素酶报道基因表达水平变化,考察青蒿琥酯对核转录因子NFATc1活化的影响。Western blot检测青蒿琥酯对LPS诱导的NFATc1信号通路上游蛋白钙调磷酸酶表达的影响。通过以Fluo-3/AM作为Ca2+探针的confocal技术考察青蒿琥酯对200s内LPS诱导的细胞内Ca2+浓度变化的影响。利用Western blot技术检测青蒿琥酯对LPS诱导的PLCyl磷酸化的影响。通过Real-time PCR和Western blot技术检测青蒿琥酯对LPS诱导的破骨细胞生成信号通路上游信号分子TLR4、TRAF6表达的影响。最后通过荧光素酶报道基因技术检测LPS刺激RAW264.7细胞NF-κB报告基因表达变化,以判断考察青蒿琥酯对NF-κB信号通路的影响。实验结果1.MTT实验发现除12.5μM青蒿琥酯干预24h、48 h、7d(生存率分别为分别为94.55%,P<0.05；85.61%,P<0.05和91.60%,P<0.05)外,0-12.5μM青蒿琥酯7d内对RAW264.7细胞无明显影响。通过TRAP染色实验发现3.125 μM (P<0.01)、6.25 μM (P<0.001)和12.5μM(P<0.001)青蒿琥酯能够显著抑制体外RANKL诱导RAW264.7细胞分化成破骨细胞,并且呈剂量依赖性(F=124.566,P<0.001)；与对RAW264.7结果一致,青蒿琥酯剂量依赖性地抑制RANKL诱导BMMs分化成破骨细胞(F=79.919,P<0.001)。通过骨吸收陷窝实验发现3.125、6.25和12.5 1μM青蒿琥酯能浓度依赖性地显著减少骨陷窝面积(F=50.855,P=0.003)。通过Real-time PCR实验发现青蒿琥酯能够浓度依赖性地显著抑制RANKL诱导的破骨细胞相关基因c-Src (F=245.807, P<0.001)、 Fra-2 (F=102.631, P<0.001)、β3-Integrin (F=21.97, P<0.001)、Cathepsin K (F=510.220, P<0.001)和MMP-9 (F=88.322, P<0.001)等mRNA表达水平上升,12.5μM浓度还对TRAP (F=403.031, P<0.001)、DC-STAMP (F=23.369, P=0.001)和Atp6v0d2 (F=427.932, P<0.001)的mRNA表达水平。通过Micro-CT扫描分析小鼠股骨的影像学特征,发现30 mg/kg青蒿琥酯和阳性对照药唑来膦酸能明显改善骨质疏松小鼠的骨组织形态,ROI(感兴趣区,region of interest)区域明显填充,体积增大,骨小梁数目明显增多且连接紧密,提示青蒿琥酯能逆转骨质疏松所致骨量减少和保护骨基质；通过分析小鼠股骨骨参数发现,青蒿琥酯与阳性对照药唑来膦酸作用一致,能显著升高骨质疏松小鼠骨矿物质密度(F=62.597,P<0.001)、骨体积分数(F=32.563,P<0.001)、骨小梁数量(F=18.005,P<0.001),降低骨小梁分离度(F=25.557,P<0.001);显著降低OVX小鼠血清中RANKL含量(F=11.208, P<0.001), RANKL/OPG比值(F=22.399,P<0.001)和TRAP-5b酶活力(F=6.937,P<0.001),升高OPG含量(F=24.557,P<0.001)和ALP酶活性(F=3.201,P<0.01)。2.对RANKL诱导的破骨细胞作用机制研究发现,青蒿琥酯3.125(P<0.001)和12.5 μM(P<0.001)浓度均能浓度依赖性地显著抑制RANKL诱导的NFATc1基因水平上调(F=123.524,P<0.001)；青蒿琥酯3.125-12.5 μM浓度下能浓度依赖性地显著增加胞浆无活性形式的NFATc1即p-NFATc1蛋白的表达量,同时也能浓度依赖性地显著抑制细胞核内NFATc1蛋白的表达,即青蒿琥酯能显著抑制RANKL诱导的NFATc1核转位；青蒿琥酯(3.125、6.25和12.5μM)与阳性对照药CsA (1 μM)均能显著降低RANKL诱导的NFAT荧光素酶报告基因表达上升(F=26.590,P<0.001)。上述三个不同层面的实验结果提示,青蒿琥酯能抑制核转录因子NFATc1的活化。青蒿琥酯在3.125-12.5μM浓度下显著抑制RANKL对NFATcl信号通路上游分子PP2B-Aa蛋白的上调。3.125和12.5μM青蒿琥酯浓度依赖性地显著降低细胞内Ca2+浓度(F=19.570,P<0.001),特别是12.5μM青蒿琥酯与阳性对照药CsA降低细胞内Ca2+浓度的作用接近于空白对照组。3.125-12.5μM青蒿琥酯浓度依赖性地抑制RANKL诱导的Ca2+信号通路上游分子p-PLCγ1蛋白水平的上调。青蒿琥酯浓度依赖性抑制RANKL/RANK信号通路上游信号分子TRAF6基因(F=41.395,P<0.001)和蛋白表达；12.5μM青蒿琥酯能显著抑制上游信号分子RANK基因表达(F=30.819,P<0.001)。阳性对照药NF-κB抑制剂BAY11-7082在5 μM浓度下能显著抑制RANKL诱导的NF-κB报告基因表达上升,抑制率约50%(P<0.05)。但是,但是,仅50μM浓度(P<0.05)的青蒿琥酯对RANKL诱导的NF-κB报告基因表达上升呈现抑制效应,3.125-25μM浓度下未见抑制效应。提示青蒿琥酯可能不是通过抑制NF-κB信号通路来影响OCs的生成与骨吸收功能。3.通过TRAP染色实验发现3.125、6.25和12.5μM青蒿琥酯能够显著抑制体外LPS诱导RAW264.7细胞分化成破骨细胞,并且呈浓度依赖性(F=67.221,P<0.001)。3.125、6.25和12.5 μM青蒿琥酯能浓度依赖性地显著抑制OCs培养液中LPS诱导的TNF-α上调(F=1 17.712,P<0.001)。3.125μL和12.5μL青蒿琥酯显著抑制LPS诱导的破骨细胞前体RAW264.7细胞的Fra-2 (F=17.440, P<0.001)、TRAP (F=40.550, P<0.001)、Cathepsin K (F=26.400, P<0.000)、 DC-STAMP (F=12.870, P=0.002)和Atp6v0d2 (F=161.500,P<0.001)等mRNA表达水平上升,12.5μL浓度还对β3-Integrin的mRNA表达水平具有显著抑制效应(F=30.900,P<0.001)。通过Micro-CT扫描分析小鼠股骨的影像学特征,发现10mg/kg青蒿琥酯能显著恢复LPS诱导的急性骨破坏模型小鼠骨量降低；通过分析小鼠股骨骨参数发现,10mg/kg青蒿琥酯能显著升高小鼠骨矿物质密度(F-7.217,P=0.014)、骨体积分数(F=6.621,P=0.017)、骨小梁数量(F=6.561,P=0.018),降低骨小梁分离度(F=5.778,P=0.024)；10 mg/kg青蒿琥酯能显著降低LPS诱导的小鼠血清中TNF-a含量(F=10.85,P=0.004)。对LPS诱导的破骨细胞作用机制研究发现,青蒿琥酯3.125和12.5μM浓度均能显著抑制LPS诱导的NFATcl基因水平上调,并且抑制效应呈浓度依赖性(F=90.330,P<0.001)；青蒿琥酯3.125-12.5μM浓度下能显著提高胞浆p-NFATc1蛋白的表达量,同时也能浓度依赖性地显著抑制细胞核内NFATc1蛋白的表达,即青蒿琥酯能显著抑制LPS诱导的NFATc1核转位；12.5μM青蒿琥酯与1μM阳性对照药CsA均能显著降低LPS诱导的NFAT荧光素酶报告基因表达上升(F=26.321,P<0.001)。上述三个不同层面的实验结果提示,青蒿琥酯能抑制LPS诱导的核转录因子NFATc1的活化。青蒿琥酯在3.125-12.5μM浓度下显著抑制LPS对NFATc1信号通路上游分子PP2B-Aa蛋白的上调。3.125(P<0.001)和12.5μM(P<0.001)青蒿琥酯浓度依赖性地显著降低细胞内Ca2+浓度(F=38.618, P<0.001)。3.125-12.5μM青蒿琥酯浓度依赖性地抑制LPS诱导的Ca2+信号通路上游分子p-PLCyl蛋白水平的上调。青蒿琥酯剂量依赖性抑制上游信号分子TRAF6蛋白表达;12.5 μM青蒿琥酯能显著抑制上游信号分子TRAF6基因(F=24.862,P<0.001)和TLR4基因表达(F=9.558,P=0.014)。阳性对照药NF-κB抑制剂BAY1 1-7082在5μM浓度下能显著抑制LPS诱导的NF-κB报告基因表达上升(P<0.001),抑制率约50%。但是,仅25(P<0.05)、50μM(P<0.01)浓度的青蒿琥酯对LPS诱导的NF-κB报告基因表达上升呈现抑制效应(F=25.501,P<0.001),3.125-12.5 μM浓度下未见抑制效应(P>0.05),提示青蒿琥酯可能不是主要通过抑制NF-κB信号通路来影响OCs的生成与骨吸收功能。实验结论1.青蒿琥酯能够显著抑制体外RANKL和LPS诱导破骨前体细胞分化形成破骨细胞,抑制破骨细胞骨吸收功能。2.青蒿琥酯具有改善去卵巢骨质疏松模型和LPS诱导的急性骨破坏模型小鼠破骨细胞过度活化所致的骨破坏、提高骨质密度的作用,可望用于治疗绝经后骨质疏松等骨破坏性疾病。3.青蒿琥酯发挥作用的靶点可能主要是衔接分子TRAF6和核转录因子NFATc1,可能主要通过抑制TRAF6-Ca2+-calcineurin-NFATc 1信号通路从而抑制破骨细胞的生成和骨破坏功能。