微孢子虫(microsporidia)是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物,它们分布广泛,能够寄生几乎所有的无脊椎动物和脊椎动物,包括鱼类、兔类、啮齿类及灵长类动物。家蚕微孢子虫(Nosemabombycis)寄生于经济昆虫家蚕,造成家蚕微粒子病。由于其可通过胚种垂直传播,危害巨大,所以在蚕业生产上被列为唯一的法定检疫对象。据统计,我国每年都会因家蚕微粒子病和带毒蚕卵造成数千万元的经济损失,因此对家蚕微孢子虫的研究和攻克微粒子病就成了家蚕研究和蚕丝产业的重点和难点。　　 微孢子虫孢壁是微孢子虫最先、最直接地与宿主接触的部分,其中的孢壁蛋白在感染宿主的过程中扮演重要角色,因此孢壁蛋白成为微孢子虫研究的热点.目前已报道的微孢子虫孢壁蛋白有13个,研究表明其在微孢子虫的侵染过程中发挥作用,但其作用机制及具体功能还未阐明。本实验室前期完成了家蚕微孢子虫重庆株CQ1的全基因组测序及基因组框架图的绘制。本研究在已鉴定的14个家蚕微孢子虫假定孢壁蛋白的基础上,选取其中假定孢壁蛋白HSWP14作为研究对象,在分析中发现其同源蛋白命名为假定孢壁蛋白HSWP15。对假定孢壁蛋白14、15进行了序列特征及转录分析,另外对二者进行克隆、表达及间接免疫荧光的定位,并进行了功能初探.旨在鉴定更多的孢壁蛋白,寻找其在家蚕微孢子虫侵染和增殖过程中所发挥的作用,为家蚕微粒子病的防治提供作用靶标。主要研究结果如下:　　 1.家蚕微孢子虫HSWP14、HSWP15的序列及转录分析　　 本实验室前期采用LC-MS/MS结合MALDI-TOFMS鉴定得到14个家蚕微孢子虫假定孢壁蛋白,其中之一为假定孢壁蛋白HSWP14。与家蚕微孢子虫蛋白质数据库比对并以同源性le-5的标准进行筛选,得到一个与HSWP14同源的蛋白质序列,命名为假定孢壁蛋白HSWP15。对二者运用生物软件和在线预测方法进行初步分析,发现二者没有已知的结构域,均有N-糖基化位点,但缺乏O-糖基化位点和肝素结合基序(HBM),说明它们可能发生翻译后糖基化修饰;基序位点预测这两个蛋白内均存在与蛋白激酶相关的基序。　　 采用四龄蚕添食家蚕微孢子虫,提取感染家蚕微孢子虫后不同时期的家蚕中肠总RNA,并以反转录后得到的sscDNA为模板对家蚕微孢子虫hswp14、hswp15进行转录分析。结果表明,hswp14、hswp15在家蚕添食微孢子虫后1-10天内可以检测到转录,推测hswp14、hswp15可能在家蚕微孢子虫侵染、增殖过程中发挥一定作用。　　 2.家蚕微孢子虫hswp14、hswp15的克隆表达及抗体制备　　 在序列和转录分析的基础上,对hswp14、hswp15进行克隆,构建表达载体pColdⅠ-HSWP14和pColdⅠ-HSWP15,分别在大肠杆菌中表达,获得了带有His标签的HSWP14、HSWP15的重组蛋白。对重组蛋白进行纯化,注射小鼠制备多克隆抗体。Westernblotting结果表明,HSWP14、HSWP15的抗血清与家蚕微孢子虫总蛋白均有免疫反应,说明hswp14、hswp15在成熟孢子中均有表达。　　 3.家蚕微孢子虫SWP14、SWP15的定位分析及功能初探　　 采用间接免疫荧光试验(IFA)对HSWP14、HSWP15定位进行分析。分别将成熟孢子和纯化后的孢壳固定处理后进行IFA检测,结果表明,HSWP14和HSWP15的抗血清均与家蚕微孢子虫孢子结合,并特异性地在孢子外表面呈现绿色荧光信号。为进一步证实这2种蛋白质均位于孢壁上,将玻璃珠破碎后纯化的孢壳经过相应的抗血清处理,可以观察到在纯化的孢壳上也具有较强的荧光信号,由此可知,SWP14、SWP15为家蚕微孢子虫孢壁蛋白。　　 随后,对SWP14、SWP15在孢子侵染宿主过程中的功能进行了初步探索。分别用SWP14、SWP15的抗血清对孢子进行封闭后统计孢子对家蚕胚胎细胞BmE-SWU1的粘附率。经过三次重复实验,结果显示经SWP14抗血清封闭的孢子对细胞的粘附率与对照相比没有明显差异,说明SWP14在家蚕微孢子虫侵染宿主的过程中不起粘附作用;而SWP15抗血清封闭后的孢子对细胞的粘附率显著低于对照,说明SWP15在侵染宿主过程中可能参与孢子与宿主间的粘附。