论文部分内容阅读
瓯柑（Sinocitrus suavissima Tseng）是浙南名果,青瓯柑被认为是普通瓯柑的滞绿突变体,其典型特征是在果实转色期和成熟期均不褪绿。青瓯柑的这一特征引起了研究者的兴趣,已有一些相关基因（主要是类胡萝卜素和ABA代谢相关基因）被报道,但对叶绿素相关表型（滞绿）形成机制尚未被完全阐释。为了更全面分析普通瓯柑和青瓯柑的差异,本文利用转录组,挖掘青瓯柑滞绿相关的候选基因,为后续的滞绿机制解析提供可依据的基础数据,同时还对CsERF13进行了序列分析和部分基因功能验证。主要结果如下:1.普通瓯柑和青瓯柑发育阶段果实采集及生理表型分析。果实发育过程中,普通瓯柑正常转色变黄,而青瓯柑则始终呈现绿色,两者色泽差异明显。在果实发育过程中两品种叶绿素含量均整体呈先微升后下降的趋势;在发育初期[75DAFB（days after full bloom）～135 DAFB]两品种间叶绿素含量无显著差异;从165 DAFB开始,两者的叶绿素含量均明显降低,但普通瓯柑下降的速度快于青瓯柑;在210 DAFB普通瓯柑的总叶绿素含量下降至不足0.01 mg·m L-1,同一时期,青瓯柑的总叶绿素含量依然维持在0.05 mg·m L-1左右;在发育阶段最后4个时期,青瓯柑叶绿素降解缓滞,其总叶绿素含量分别是普通瓯柑的4.3倍、5.6倍、7.6倍及4.0倍。而类胡萝卜素含量在两品种间差异较小,整体维持在3.0mg·m L-1浓度;有趣的是在转色期（165 DAFB、180 DAFB、195 DAFB）青瓯柑的类胡萝卜素含量甚至略高于普通瓯柑,分别高出21.7%,37.8%和67.2%。可溶性糖和有机酸含量测定的结果显示,果皮中,苹果酸和蔗糖含量在两品种间存在差异,表现为苹果酸含量在青瓯柑果皮中较高,蔗糖含量在普通瓯柑中更高;而果肉中,普通瓯柑的苹果酸含量更高,其他组分差异不大。总体上,普通瓯柑和青瓯柑可溶性糖与有机酸的差异较叶绿素含量的差异小。2.开展了转录组测序和加权相关网络分析（WGCNA）。通过筛选差异表达基因并结合KEGG pathway分析,发现普通瓯柑和青瓯柑在转色初期（165 DAFB）存在大量的植物激素信号转导途径差异表达基因（包含13个基因,涉及7个植物激素信号转导途径）,其中乙烯信号转导途径与植物成熟衰老紧密相关。验证了该通路的差异表达基因CsEBF1在果实发育阶段的表达量,发现其在青瓯柑中的表达量始终高于普通瓯柑,且CsEBF1与下游基因CsEIN3（3个同源基因）存在互作,推测在青瓯柑中CsEBF1可能通过泛素化降解CsEIN3导致其对乙烯不敏感,从而造成滞绿现象。WGCNA分析显示青绿色模块（MEturquoise）与叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量相关性最高（0.81、0.85、0.83）,设置k ME值大于0.9,基因显著性值大于0.75的筛选标准,筛选到54个与叶绿素含量相关的差异表达基因（未见叶绿素降解相关基因）。分析青绿色模块的全部基因,发现该模块中存在与叶绿素降解相关的基因Cs CLH1-1和Cs CLH1-2（k ME值与基因显著性值不在筛选标准内）且在普通瓯柑和青瓯柑中表达有差异,但它们转录丰度仅存在2倍左右的差异。筛选并进行实时定量PCR验证了与叶绿素代谢相关基因FC2、Cs CLH1-1和Cs CLH1-2以及与植物成熟衰老相关基因2-MMP、SAG20和转录因子ERF109、b ZIP53的表达,结果与转录组相符。通过双荧光素酶实验验证了ERF109对Cs CLH1-1和Cs CLH1-2的启动子具有转录抑制效应,该结果进一步显示ERF109可能通过转录抑制CLH1而影响青瓯柑滞绿的进程。3.CsERF13是调控柑橘叶绿素降解的重要转录因子之一,然而其在普通瓯柑和青瓯柑发育阶段的转录水平差异极小,无法充分阐明两者存在的显著叶绿素含量的差异。鉴于此,我们进而分析了CsERF13基因序列的差异。结果显示,在普通瓯柑和青瓯柑不同组织中,存在长度分别为660 bp和675 bp的2种CsERF13序列类型;在普通瓯柑果皮中2种序列均存在;而青瓯柑果皮中仅含有675 bp序列类型。这一结果同样适用于其他柑橘品种。在分析的12种柑橘品种中,存在4种长度不同的CsERF13序列类型,分别为657 bp、660 bp、672 bp和675 bp。多数柑橘品种（可正常褪绿）的果皮中含有以上2种长度的CsERF13序列类型。双荧光素酶分析结果显示,长度不同的CsERF13序列类型对PPH启动子的调控效应存在差异,675 bp的长序列类型的转录调控效应弱于660 bp,说明青瓯柑叶绿素降解速率减缓很可能是由于CsERF13序列长短不同而导致的。综上所述,普通瓯柑和青瓯柑生理表型存在显著差异。在此基础上,开展了转录组分析,筛选并验证了基因的表达情况,这些候选基因为后续研究青瓯柑滞绿机制提供了重要的基础。长短不同的CsERF13序列类型也可能是引起普通瓯柑和青瓯柑叶绿素降解速率差异的重要基因。