牛肠道病毒(bovine enterovirus,BEV)是小RNA病毒科肠道病毒(enterovirus,EV)属成员之一,为无囊膜的单股正链RNA病毒。该病毒存在于多种动物机体内并且能够引起其呼吸系统和消化系统的疾病,在牛群及其周边环境中也普遍存在。BEV通常与其他病毒或细菌混合感染或是继发感染,进而引起动物多种疾病的暴发。本研究目的是建立一种RT-PCR方法来对青藏高原部分地区牦牛腹泻和健康粪便样本进行EV的流行病学调查,并且从牦牛腹泻粪便样本中分离鉴定出EV;应用PCR扩增技术获得该分离株的全基因序列,并且分析其遗传进化关系;利用转录组学研究该分离株感染MDBK早期和持续期mRNA的转录表达调控,从mRNA水平分析病原与细胞之间的相互作用,取得的结果如下:1.牦牛EV的流行病学调查和分离鉴定为了对西藏、青海、四川、云南等青藏高原地区235份犊牦牛腹泻粪便样本和116份健康粪便样本进行牦牛EV的流行病学调查,本研究建立了一种快速检测牦牛EV的RT-PCR方法,该方法的灵敏度较高,阳性质粒的检测下限为0.0876pg/μL(2.65×103 copies),具有较好的稳定性和特异性。检测结果如下,腹泻样本中的牦牛EV的阳性率为31.06%(95%CI=25.2%-37.4%),健康样本的阳性率为24.14%(95%CI=16.7%-33%),利用SPSS软件分析两者之间的差异不显著(P=0.11)。分别分析四个地区的腹泻和健康样本中的阳性率是否存在差异性,结果显示,仅有西藏地区两者之间差异显著(P=0.001),分析牦牛EV在西藏地区的腹泻样本中该病毒的流行率比健康样本的较高(比值比=6.03,95%CI=1.93%-18.86%),说明牦牛EV是构成犊牛腹泻的潜在因素。利用MDBK细胞从牦牛腹泻粪便样本中成功分离出一株EV毒株,可在接毒后16-18 h出现明显的CPE,TCID50是10-7.02/mL。电镜检查该分离株的粒子大小在25-28 nm之间,呈圆球状,与已报道的EV的病毒粒子大小、形状一致,并将该分离株命名为SWUN-AB001。2.牦牛EV分离株SWUN-AB001的全基因组测序与分析根据GenBank已公布的14组BEV全基因序列,利用Primer 5.0软件选择相对保守区的序列设计出15对引物,通过PCR技术扩增SWUN-AB001的全基因序列,利用BioXM、DNAMAN等软件对SWUN-AB001的全基因测序结果进行组装和拼接,该毒株的全基因序列总长为7383 bp,G+C%的含量为51.1%。该分离株的基因结构特征符合EV的报道。应用MEGA6.06分析SWUN-AB001与其他BEV及EV的遗传进化关系,分别建立了ORF、5’UTR、VP1、P1、P2、P3遗传进化树关系图,在不同区域的进化树中的SWUN-AB001分离株均位于一个独立的分支,该分离株与BEV-F型毒株PS87(GenBank accession NO.DQ092795)遗传关系最相近,同时与此毒株的同源性分别为72.8%/76.9%(P1),77.6%/91.9%(P2),79.1%/94.8%(P3),71.1%/79.2%(VP1)。按照EV的分类标准,即VP1区核酸同源性与已知基因型肠道病毒同源性<75%(氨基酸同源性<88%)则认为所测病毒为一新基因型,经国际病毒分类委员会(ICTV)将SWUN-AB001株鉴定为一新基因型EV,即EV-F7。利用GARD软件检测该全基因序列中存在的重组位点位于VP1基因内的2594 bp和2625 bp处。SWUN-AB001作为EV种属中一个新的基因型,有助于更进一步的了解青藏高原地区牦牛EV的流行病学特点。3.牦牛EV-F7分离株SWUN-AB001感染MDBK细胞的转录组学研究为了进一步分析牦牛EV-F7分离株SWUN-AB001引起牦牛腹泻疾病的致病机制,本研究对该病毒株感染MDBK细胞早期和持续期的转录组学进行探索。通过间接免疫荧光的方法观察0.01MOI的病毒量感染MDBK细胞不同时间点(6h,12 h,24 h,36 h)的荧光变化来分析该毒株感染MDBK细胞的早期和持续期,同时应用qRT-PCR的方法验证。应用RNA-Seq技术对病毒感染早期和持续期的细胞样本进行高通量转录组测序分析,研究不同感染时间内的差异基因,应用qRT-PCR方法验证所获得的差异表达基因的准确性。免疫荧光结果表明,初步判断该病毒分离株感染MDBK细胞早期和持续期的时间分别是感染细胞后12 h和24 h,并应用qRT-PCR的方法从病毒的含量差异上验证了病毒感染细胞早期和持续期的时间点。病毒感染MDBK细胞12 h和24 h所建文库获得的clean reads平均数目分别为23,949,550和23,952,446,对照组分别为23,952,280和23,952,647。在病毒感染MDBK细胞12 h期间,仅有19个基因差异表达,其中包括12个上调基因和7个下调基因;持续感染至24 h期间,总共发现有1050个差异表达基因,包括947个下调基因和103个上调基因,在其众多的差异表达基因中发现有多种促炎因子和趋化因子是病毒感染过程中所释放的,包括IL-6、IL-11、LIF、GM-CSF和CSF2,并用qRT-PCR方法验证的结果显示与转录组数据分析结果有着相同的表达趋势。在这两个时间段内分别筛选出的差异表达基因中有12个重叠基因,其中有10个是上调基因2个下调基因。GO富集分析表明在病毒感染细胞12 h期间,仅有14个差异表达基因在GO功能注释中,主要涉及的是生物过程部分;持续感染至24 h期间,共有697个功能基因在GO功能注释中,主要涉及分子功能、细胞成分及生物过程。KEGG富集分析表明,在病毒感染MDBK细胞12 h期间,分别在上调和下调的差异表达基因中涉及4和2个KEGG通路。持续感染至24 h期间,下调的差异表达基因中涉及33个KEGG通路,包括疾病、代谢和有机体系统;上调的差异表达基因中涉及31个KEGG通路,主要集中在疾病和信号转导通路,其中包括MAPK信号通路参与了病毒的复制过程,应用western blot技术验证了牦牛EV-F7感染细胞24 h后,JNK/SAPK和p38 MAPK的磷酸化表达水平明显增加,说明该病毒在感染细胞过程中激活了MAPK信号通路,促进了病毒在细胞中的复制,导致多种炎性细胞因子的释放。这些结果为进一步研究牦牛EV-F7的感染机制和病毒与宿主之间潜在的分子关系提供了基础。