卵巢癌是女性生殖系统常见的一种恶性肿瘤,发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌,但其死亡率却高居榜首。在女性所有恶性肿瘤中,卵巢癌的死亡率排第五。多数卵巢癌患者早期并无症状,且由于卵巢位于腹腔深处,早期筛查较困难。卵巢癌患者中,仅有15%的患者能在早期(FIGO I-II期)诊断。卵巢癌患者中,上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)占所有卵巢恶性肿瘤病理类型的75%-80%。因此,EOC的早期诊断、治疗一直是国内外的研究热点。由于EOC在腹腔内易于种植、转移的特性,探讨上皮性卵巢癌的侵袭、转移和增殖等恶性行为的机制,找寻有效的治疗靶点具有重要的科研和临床意义。Nck家族蛋白是一类重要的衔接蛋白,主要参与酪氨酸激酶信号的传导。Nck蛋白参与调控细胞骨架的重排,在细胞定向迁移运动、血管生成、T细胞受体信号和T细胞的激活等方面也起着重要作用。同时,Nck在乳腺癌、胰腺癌、肝癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤的侵袭、迁移等恶性行为中也具有重要作用。提示我们,Nck蛋白在EOC的恶性侵袭行为中亦可能发挥着重要作用。第一部分Nck1在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义目的:检测Nck1蛋白在不同病理类型卵巢肿瘤组织中的表达情况,分析Nck1表达与EOC患者预后的关系。方法:采用免疫组化和Western blot检测Nck1蛋白在289例EOC患者的石蜡切片标本和95例新鲜手术标本中表达情况;通过免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察Nck1在卵巢癌细胞中的定位;对EOC患者的Nck1的表达情况和生存时间、复发时间进行生存分析;建立Cox单因素和多因素回归模型分析影响EOC患者预后的因素。结果:(1)通过免疫组化观察到在多数正常卵巢和输卵管组织(77.5%)、交界性上皮性卵巢肿瘤组织(51.28%)和良性上皮性卵巢肿瘤组织(71.88%)中,Nck1蛋白表达呈阴性。在176例EOC组织中Nck1均有表达,其中73.3%(n=129)为高表达,26.7%(n=47)为低表达。通过分析EOC组中Nck1高表达和临床病理特征之间的关系,发现Nck1高表达与患者FIGO分期、病理等级、术后残余肿瘤体积、血清Ca125水平显著相关(P<0.05)。(2)通过Western blot共检测95例样本,结果显示,EOC组Nck1蛋白表达水平(1.351±0.494)明显高于正常卵巢(0.395±0.110),良性上皮性卵巢肿瘤(0.392±0.143)和交界性上皮性卵巢肿瘤(0.531±0.170,P<0.05)。此外,通过分析42例EOC患者中临床病理特征与Nck1表达水平的关系发现,Nck1高表达与FIGO分级、病理级别、术后残余肿瘤大小以及血清CA-125水平有关,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)为了分析Nck1高表达与患者临床预后之间的关联,作者对176名EOC患者进行了10年的随访。通过Kaplan-Meier方法分析显示,Nck1低表达组患者总生存时间和无瘤生存时间均高于Nck1高表达组(P<0.05)。(4)通过单因素Cox分析发现,年龄≥50岁,FIGO分期III-IV期,病理高级别,腹水≥100ml,残余肿瘤大小≥1cm,血清CA-125水平≥900U/ml和Nck1高表达的患者总生存时间较短。多因素Cox分析显示,Nck1高表达,FIGO分期III-IV期,术后残留肿瘤大小≥1cm以及血清CA-125水平≥900U/ml是总体生存率差的独立预后因素。(5)Nck1在三种人卵巢癌细胞系(SKOV3、OVCAR-3和ES-2)中均有较高的表达水平。通过免疫荧光实验发现Nck1表达主要定位于SKOV3和OVCAR-3细胞的细胞质和细胞膜。结论:(1)Nck1蛋白在EOC组织和细胞中呈高表达。(2)Nck1高表达,FIGO分期III-IV期,术后残留肿瘤大小≥1cm以及血清CA-125水平≥900U/ml是总体生存率差的独立预后因素。第二部分Nck1慢病毒表达载体的构建及稳转人卵巢癌细胞系的建立目的:构建带有Zs Green荧光标记和嘌呤霉素抗性基因的Nck1重组干扰慢病毒载体及带有NEO抗性基因的Nck1过表达慢病毒载体,筛选并建立Nck1显著低表达及高表达的稳转人卵巢癌细胞系,为后续实验奠定基础。方法:(1)针对Nck1基因序列,设计并合成3对特异性人Nck1基因干扰序列;将扩增的PCR产物和慢病毒载体进行双酶切,然后将干扰片段连接入表达载体并转入细菌感受态细胞;转化子送测序验证。测序验证正确的克隆,进行高纯度质粒抽提。(2)将构建成功的重组质粒和慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收集病毒上清液,通过超速离心获得慢病毒超离液后测定滴度。(3)将获得的慢病毒载体转染人卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞,通过荧光显微镜和药物筛选出稳定转染的细胞株。(4)通过Werstern blot和RT-PCR验证转染的细胞中Nck1的表达情况,获得Nck1显著低表达及过表达的稳转细胞系。结果:(1)根据Nck1基因的转录本设计了三个si RNA靶点并合成引物,双酶切实验和DNA测序证实阳性克隆序列正确,成功构建了带有Zs Green荧光标记和puro抗性基因的Nck1重组干扰及过表达慢病毒载体,转染293T细胞后在荧光显微镜下可观察到强烈的荧光,并测定滴度为2×108TU/ml;同时成功构建Nck1过表达慢病毒载体。(2)根据慢病毒转染操作方法,向SKOV3和OVCAR3细胞中分别加入Nck1-NC、Nck1-sh RNA1、Nck1-sh RNA2、Nck1-sh RNA3及Nck1过表达的病毒。感染后再用药物筛选出感染效率>90%的稳转细胞。(3)通过Western blot和Real time-PCR的方法验证了卵巢癌细胞系中Nck1蛋白和m RNA抑制效率,筛选出Nck1低表达及过表达的稳转细胞进行后续实验。结论:课题组成功构建了Nck1 sh RNA慢病毒干扰及过表达载体,筛选并建立了Nck1显著低表达及高表达的稳转人卵巢癌细胞系,为后续实验奠定了基础。第三部分Nck1基因沉默对上皮性卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响目的:通过体内实验和体外实验探讨Nck1对EOC细胞恶性生物学行为的影响,进一步探讨Nck1参与了EOC的发生、发展过程的可能机制。方法:通过免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察Nck1基因沉默对SKOV3细胞形态学的影响;通过Transwell侵袭、迁移实验和细胞粘附实验检测Nck1基因对卵巢癌细胞侵袭、迁移以及粘附能力的影响;通过CCK-8增殖实验和软琼脂克隆形成实验检测Nck1基因对卵巢癌细胞增殖能力的影响;通过构建裸鼠皮下成瘤和腹腔成瘤动物模型,观察Nck1基因沉默对卵巢癌细胞体内成瘤能力的影响。结果:(1)与对照组(SKOV3-NC)相比,Nck1沉默组(SKOV3/Nck1-)形成的片状伪足和丝状伪足明显减少,细胞形态变圆、变钝。(2)Transwell侵袭实验及迁移实验均显示Nck1沉默组(SKOV3/Nck1-和OVCAR3/Nck1-)穿过包被了Matrigel胶的聚碳酸酯膜的细胞数较对照组显著减少;Nck1过表达细胞(SKOV3/Nck1+和OVCAR3/Nck1+)穿过膜的细胞数显著增加。(3)CCK-8增殖实验显示,与对照组相比,在共培养4h、24h、48h、72h和96h后,Nck1沉默组(SKOV3-sh RNA3和OVCAR3-sh RNA1)细胞增殖速率显著减缓,Nck1过表达细胞(SKOV3/Nck1+和OVCAR3/Nck1+)增殖速率显著增加。软琼脂克隆形成实验显示细胞克隆形成数目显著减少。(4)皮下成瘤动物模型显示,与对照组相比,Nck1沉默组(SKOV3/Nck1-)皮下成瘤率更低,瘤体直径更小,瘤体表面新生血管更少。腹腔成瘤模型显示Nck1沉默组形成的肿瘤结节的体积明显小于对照组,形成的肿瘤结节数量明显少于对照组。结论:抑制Nck1基因表达可以改变卵巢癌细胞形态,抑制卵巢癌细胞体外迁移、侵袭和增殖能力,同时抑制卵巢癌细胞体内成瘤的能力。第四部分Nck1通过调节下游磷酸化激酶活性影响上皮性卵巢癌恶性生物学行为的机制探讨目的:探讨Nck1参与EOC恶性生物学行为可能的分子机制。方法:HE染色观察Nck1沉默后裸鼠皮下移植瘤组织形态学的变化;通过Western blot检测Nck1沉默后裸鼠皮下移植瘤组织中与血管生成、侵袭转移相关蛋白VEGF、MMP-2、MMP-9变化;采用人磷酸化激酶抗体芯片检测Nck1沉默后对下游相关磷酸化激酶信号通路的变化的影响。结果:(1)通过HE染色发现,与对照组相比,Nck1沉默组的肿瘤细胞排列相对整齐,细胞大小、形态较接近,病理性核分裂相更少。(2)Nck1沉默组的Nck1蛋白明显下调,且随着Nck1的表达下降,MMP-2、MMP-9以及VEGF的表达也明显下降,差异具有统计学意义。(P<0.05)(3)通过人磷酸化蛋白激酶抗体芯片,共检测到11种磷酸化激酶在Nck1基因沉默后表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)Nck1主要通过增强PI3K/AKT/p70S6K信号参与调控卵巢癌细胞增殖、侵袭的能力。结论:(1)Nck1可能通过调节MMP2、MMP-9和VEGF的表达促进卵巢癌细胞侵袭、转移等恶性行为。(2)Nck1可能通过增强PI3K/AKT/p70S6K信号参与调节EOC细胞的恶性行为。全文总结:通过Nck1在上皮性卵巢癌组织中的表达及促进其侵袭、转移机制的初步研究,得到研究结论如下:(1)Nck1蛋白在EOC组织和细胞中呈高表达。(2)Nck1高表达,FIGO分期III-IV期,术后残留肿瘤大小≥1cm以及血清CA-125水平≥900U/ml是总体生存率差的独立预后因素。(3)课题组成功构建了Nck1 sh RNA慢病毒干扰载体,筛选并建立了Nck1显著低表达的稳转人卵巢癌细胞系,为后续实验奠定了基础。(4)干扰Nck1基因表达可以改变卵巢癌细胞形态,抑制卵巢癌细胞体外迁移、侵袭和增殖能力。(5)干扰Nck1基因表达可以抑制卵巢癌细胞体内成瘤的能力。(6)Nck1可能通过调节MMP2、MMP-9和VEGF的表达参与了血管形成,促进卵巢癌细胞侵袭、转移等恶性行为。(7)Nck1可能通过增强PI3K/AKT/p70S6K信号参与调节EOC细胞的恶性行为。