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研究背景与目的鼻型NK/T细胞淋巴瘤是一种特殊类型的非霍奇金淋巴瘤,以往称之为“中线恶性网织细胞增多症”,“血管中心性淋巴瘤”,“中线致死性肉芽肿”等,本病常侵犯眼眶、鼻腔、鼻窦、鼻咽、上腭、口腔、喉等面中线部位,也会累及皮肤、肠道、肺、脑、睾丸等部位。肿瘤常造成组织的肉芽肿型损伤,病灶内黏膜充血、肿胀,出现难愈性溃疡,产生大量干痂和坏死组织。光镜下,瘤组织呈血管中心性生长,肿瘤细胞大小不一,缺少典型的细胞学特性,常与大量坏死组织和炎性细胞混杂在一起,诊断起来非常困难。传统的诊断方法是综合临床表现、形态学特征和免疫组织化学结果三方面信息进行判断,在处理比较典型的病例时尚可胜任,然而,当遇到复杂多变的病例时,仍难以作出明确的诊断。近年来,随着分子生物学技术的提高和基因研究的不断深入,诊断鼻型NK/T细胞淋巴瘤的方法也开始日趋丰富。自从有学者证实一部分鼻型NK/T细胞淋巴瘤TCR基因单克隆性重排阳性之后,多聚酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)法检测T细胞受体基因(T-cell receptor, TCR)重排得到了逐渐广泛的应用,并在鼻型NK/T细胞淋巴瘤的诊断和瘤细胞分型中发挥重要的作用。然而此项检查最理想的标本乃新鲜冰冻组织,在实际临床工作中,要求每一例受测对象均保有新鲜冰冻组织并不现实,如能在常规的石蜡包埋组织上开展此项检查,便会极大地改善临床工作,提高诊断效率。本实验旨在以新鲜冰冻组织检测结果为参照,探讨相同病例的石蜡包埋组织检测结果与之的统计学差异,从而查明石蜡包埋组织对于鼻型NK/T细胞淋巴瘤TCR基因重排检测的可靠性。材料与方法1.实验材料及分组收集2009年10月至2010年12月间在复旦大学附属眼耳鼻喉科医院进行活检的鼻型NK/T细胞淋巴瘤疑似病例,每例瘤组织分为两部分,一部分常规石蜡包埋,另一部分制成新鲜冰冻组织。切取石蜡包埋组织进行HE染色,并根据需要加做免疫组织化学染色,结合临床表现进行诊断,选出其中经病理科确诊的鼻型NK/T细胞淋巴瘤30例。将此30例病人的石蜡包埋组织和相应的新鲜冰冻组织编为实验标本,分成石蜡标本组和新鲜冰冻标本组。另取10例鼻息肉石蜡包埋组织作为阴性对照组。2.实验方法收集的活检组织进行HE染色,显微镜下观察,根据需要加做免疫组织化学染色,结合临床表现,由病理科医生进行诊断。将确诊为鼻型NK/T细胞淋巴瘤的病例的石蜡包埋组织和新鲜冰冻组织编为实验标本,分成石蜡标本组和新鲜冰冻标本组。普通法切取石蜡标本组标本,刮片法切取新鲜冰冻标本组标本。按照QIAamp DNA Micro Kit提供的操作步骤抽提标本基因组DNA,从文献选取经典TCRβ和TCRγ引物,采用热启动法PCR,扩增后进行2%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察标本TCR基因单克隆性重排是否为阳性。用配对x2检验比较鼻型NK/T细胞淋巴瘤石蜡标本组与新鲜冰冻标本组结果的差异。结果1.苏木素-伊红(hemaxylene-eosin,HE)染色光镜下可见鼻型NK/T细胞淋巴瘤组织呈血管中心性生长,肿瘤细胞大小不一,核型不规则,与大片坏死组织与多量炎性细胞混杂在一起。2.免疫组织化学染色30例鼻型NK/T细胞淋巴瘤中,19/30例(63.3%)T淋巴细胞内抗原1(Tlymphocyte intracellular antigen-1, TIA-1)日性,29/30例(96.7%)胞浆CD3阳性,29/30例(96.7%)CD56阳性,23/30例(76.7%)颗粒酶素B(granzymeB, GB)阳性,30/30例(100%)白细胞共同抗原(Leukocyte Common Antigen,LCA)阳性,30/30例(100%) UCHL-1(CD45RO)阳性。3.TCR基因重排结果30例鼻型NK/T细胞淋巴瘤与10例鼻息肉组织的实验标本所提取出的DNA模板,经人β球蛋白引物扩增后,均能出现相应的基因片段。30例鼻型NK/T细胞淋巴瘤TCR基因单克隆性重排结果如下：15/30例(50.0%)石蜡标本为阳性,17/30例(56.7%)冰冻标本为阳性。有14例瘤组织其石蜡标本与新鲜冰冻标本同时阳性；3例组织其新鲜冰冻标本为阳性,而石蜡标本阴性；有1例组织其新鲜冰冻标本阴性,而石蜡标本阳性。10例鼻息肉标本TCR基因单克隆性重排均为阴性。采用配对x2检验比较鼻型NK/T细胞淋巴瘤石蜡标本组与新鲜冰冻标本组的检测结果,P=0.625>0.05,两组结果之间无显著统计学差异。结论对于PCR法检测鼻型NK/T细胞淋巴瘤TCR基因单克隆性重排,石蜡标本与新鲜冰冻标本结果无显著统计学差异。临床将以石蜡标本为基础的TCR基因单克隆性重排检测作为鼻型NK/T细胞淋巴瘤常规诊断与鉴别诊断的辅助手法是可行的。TCR基因单克隆性重排阴性者亦不可排除鼻型NK/T细胞淋巴瘤的诊断。即便新鲜冰冻组织检测结果为阴性,也不可排除组织存在TCR基因单克隆性重排。