随着高毒性有机磷杀虫剂的限制和禁止使用,以毒死蜱为代表的低毒性有机磷杀虫剂的市场份额有所增加。然而,毒死蜱的使用也导致了环境中3,5,6-三氯-2-吡啶醇(3,5,6-trichloro-2-pyridinol,以下简称TCP)的产生。因为TCP是毒死蜱和甲基毒死蜱在环境中降解的主要中间代谢产物,它具有较高的水溶性和迁移性,容易进入深层土壤及水体环境,从而引起广泛的污染。TCP对环境微生物的毒性比毒死蜱更高,它对土壤细菌群落的毒性是毒死蜱的2.5倍。TCP在环境中蓄积后,对环境中真菌和细菌的生长有较强的抑制作用,可以抑制TCP及其母体化合物毒死蜱和甲基毒死蜱的生物降解,同时也抑制其他有机化合物的生物降解,从而进一步加重环境中TCP以及其它有机污染物的累积残留,影响环境系统的自我修复功能。生物修复因具有高效、安全、成本低、无二次污染以及生态恢复性好等优点而具有美好的发展前景。目前,有关TCP降解菌的报道不多,而绝大多数降解菌对TCP降解效率不高,完全降解50-100 mg/L的TCP需要4-30 d的时间。与TCP降解相关的基因和酶鲜有报道,TCP降解途径还没有完全阐明。本文旨在分离高效TCP降解菌株,研究其降解TCP的机制,以期为TCP污染环境的微生物修复提供理论依据和技术支持。一、TCP降解菌株的分离和鉴定通过富集培养的方法,从长期生产毒死蜱化工厂污水处理系统的样品中分离筛选到一株能以TCP为唯一碳源生长的菌株P2,该菌株在30 ℃、pH 7.0、150 rpm培养时,能在10 h内完全降解100 mg/L的TCP,也可以在70 h内完全降解浓度高达800 mg/L的TCP。菌株P2不仅是目前降解TCP最快的菌株,同时也是目前能耐受最高浓度TCP的降解菌株,这说明菌株P2对环境中高浓度TCP污染的修复有着明显的优势。与该菌株16S rRNA基因序列相似性较高的菌株皆来自贪铜菌属(Cupriavidus),与Cupriavidus pauculusLMG3413T的序列相似性最高,为99.7%。结合其形态特征和生理生化特性,该菌株被鉴定为贪铜菌(Cupriavidussp.P2)。二、TCP降解菌株P2的生长和降解特性的研究菌株P2在LB培养基中的最适生长温度为30℃;最适生长初始pH是7.0;最适生长NaCl浓度为5g/L;当250mL的三角瓶装液量小于100mL时,菌株P2生长旺盛。在供试碳源中,菌株P2对葡萄糖和果糖的利用最好;在供试无机氮源中,菌株P2对NH4N03利用最好;菌株P2对氨苄青霉素有抗性,可以耐受100mg/L的氨苄青霉素,对卡那霉素、氯霉素、链霉素、红霉素、庆大霉素、壮观霉素、万古霉素和四环素等敏感。菌株P2在30℃,pH 7.0时降解TCP的效果最好;在NaCl浓度为5 g/L时TCP的降解效率最高;在一定的范围内,TCP降解率与接种量和通气量成正相关。在1 mmol/L的条件下,Fe2+、Mn2+和Ca2+对TCP降解没有显著的影响,Co2+、Zn2+和Ni2+对TCP降解有较强的抑制作用,Cu2+严重抑制菌株P2对TCP降解。菌株P2不仅能够完全降解100 mg/L的TCP,而且能够完全降解100 mg/L的2,4,6-三氯苯酚。高效液相色谱检测到TCP降解过程中在保留时间Rt=3.737min和Rt=8.809 min各出现一个产物峰;当溶液中TCP全部降解之后,绿色产物依然存在,而此时释放到溶液中的氯离子是初始TCP物质的量浓度的3倍,证明绿色产物是TCP分子上的三个氯原子全部释放后产生的,因此,在菌株P2中存在着脱氯酶。接种12h后,在保留时间为Rt=3.737 min和Rt=8.809 min的产物峰以及绿色代谢产物全部消失,初步表明菌株P2可以矿化TCP。三、TCP脱氯酶基因簇的克隆及其分析通过转座子突变的方法建立了菌株P2的突变株文库,从7800个文库菌株中筛选到三株丧失TCP降解能力的突变株P1-M1、P1-M2和P1-M3。通过SEFA-PCR,分别扩增出突变株P1-M1、P1-M2和P1-M3中Tn5转座子插入位置的上下游序列。将其测序后进行分析和拼接,得到一个长度为6012 bp的DNA片段,对其中完整的ORF分别进行分析,结果显示,它是一个包含五个基因的基因簇。orf1(负链,5-841 bp)编码的蛋白与Cupriavidus necator N-1的FMN腺苷酰转移酶有最高的氨基酸序列相似性(85.92%)。tcpR1(负链,933-1904 bp)编码的蛋白与Ralstoniasp.T6的LysR家族的转录调控因子有最高的氨基酸序列相似性(99.38%)。tcpB1(正链,2053-2604bp)编码的蛋白与Ralstonia sp.T6的黄素还原酶有最高的氨基酸序列相似性(98.91%),与已报道的Ralstonia eutropha JMP134的黄素还原酶(TcpX)有较高的氨基酸序列相似性(88.11%)。tcpA1(正链,2709-4262 bp)编码的蛋白与已报道的Ralstonia eutropha JMP134的2,4,6-三氯苯酚的单加氧酶有最高的氨基酸序列相似性(96.64%),该酶负责2,4,6-三氯苯酚的脱氯,是一个依赖FADH2的单加氧酶。因此,我们推测tcpA1很可能是一个脱氯酶基因。orf2(正链,4633-5502 bp)编码的蛋白与Cupriavidus necator N-1的马来酰乙酸还原酶有最高的氨基酸相似性(92.01%)。对Tn5转座子在突变子P2-M1、P2-M2和P2-M3中插入位置进一步分析发现,三个突变子分别是由于DNA中的tcpR1、tcpB1和tcpA1的失活而丧失TCP降解能力,这初步证明了基因tcpR1、tcpB1和tcpA1都与TCP的降解有关。四、TCP脱氯酶基因的表达及其产物特性的研究将基因tcpA1和tcpB1分别克隆到表达载体pET29a上,在E.coli BL21中进行重组表达。结果显示,重组表达菌株E.coli BL21(pET29a-tcpB1)和E.coli BL21(pET29a-tcpA1)都不能单独降TCP,但是,它们的混合培养物则具有降解TCP的能力,这说明基因tcpB1和tcpA1共同负责TCP的脱氯反应。同时,TcpA1催化TCP脱氯时不仅依赖于辅因子FAD和NADH的存在,而且依赖于TcpB1的存在。而酶反应液中产生的氯离子刚好是初始TCP物质的量浓度的3倍,表明此时TCP分子上的三个氯原子已经被完全脱去,所以TcpA1是负责TCP脱氯的酶。通过亲和层析纯化了 TcpA1和TcpB1,TcpB1在SDS-PAGE图的大小为19 kDa左右,TcpA1的大小为58 kDa左右,这与TcpB1和TcpA1的理论分子量一致。TcpA1不仅能够催化TCP的脱氯,而且还能催化2,4,6-三氯苯酚的脱氯,TcpA1以TCP为催化底物时有较低的Km值(34.75 μM),较高的催化效率值kcat/Km(1.01μM-1s-1),这表明TCP是TcpA1的最适底物。TcpA1酶学特性研究表明,当反应的温度和pH分别为30 ℃和pH 8.0时,TcpA1催化TCP脱氯反应的酶活性最高。不同的金属离子对TcpA1的活性有不同的影响,Cu2+,Zn2+和Hg2+离子强烈地抑制TcpA1的活性,Fe2+离子在低浓度(0.2 mM)时对酶TcpA1的活性有轻微的促进作用,但是在高浓度的条件下(2 mM)对酶的活性却有轻微的抑制作用。本文也鉴定了 TCP经过TcpA1和TcpB1共同催化后生成的绿色产物,并提出了 TcpA1和TcpB1在TCP脱氯中的作用。五、菌株P2修复TCP污染土壤的初步研究在实验室条件下初步研究了菌株P2对TCP污染土壤的生物修复作用。结果表明,接种菌株P2可以显著促进土壤中TCP降解。生物修复中菌株P2的最佳使用条件为:接种量为1.0×106CFU/g干土;pH7.0;30℃;土壤最适含水量为30%。在此条件下菌株可以在15 d内完全降解100 mg/kg干土的TCP。同时,韭菜的种植可以促进菌株P2对土壤中TCP的降解。显示了菌株P2在TCP污染土壤生物修中的应用潜力。