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目的:确定秦艽-威灵仙配伍(以下简称秦威药对)水煎液及有效成分对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(Rheumatoid arthritis fibroblast-likesynoviocytes,RA-FLSs)的疗效,分析中药水煎液及有效成分对相关靶点的作用,借助实验验证并阐释网络药理学的分析结果,探讨秦威药对水煎液治疗RA的作用机制。方法:1.网络药理学分析秦威药对与RA的关系1)通过Drug Bank和TTD数据库检索与RA发病相关的疾病靶点,构建RA疾病靶点库;2)借助TCMSP数据库检索秦威药对的成分,以OB≥30%和DL≥0.18为标准筛选活性成分,并查阅文献补充文献报道中常见的秦威药对的活性成分,汇总得到活性成分库;3)借助Swiss Target Prediction数据库分析活性库中各活性成分的作用靶点,通过VEENY平台映射筛得治疗RA的重要靶点并通过Cytoscape构建秦威药对的“活性成分-重要靶点”网络以筛选重要成分和核心靶点;4)将核心靶点通过STRING数据库建立互作网络图;5)利用David平台进行KEGG信号通路以及GO分析生物过程富集整理重要通路和重要生物过程。2.高效液相色谱法(HPLC)验证秦威药对的网络药理学分析结果采用安捷伦883975-902 ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm);流动相A为0.04%磷酸水溶液(0~28 min,85%A→77%A;28~35 min,77%A→65%A);流动相B为甲醇,采用梯度洗脱法洗脱色谱柱(0~28 min,15%B→23%B;28~35 min,23%B→35%B);流速设置为0.8 m L·min-1;柱温设置为30℃;检测波长设置为245 nm;进样量设置为5μL,以检测秦威药对水煎液中是否含有方法1中网络药理学分析得到秦威药对中的重要成分,对网络药理学分析结果可靠性进行考察。3.细胞增殖/毒性检测试剂盒(CCK-8)检测给药后RA-FLSs的增殖活性取对数生长期细胞,采用随机数字表法将其分为空白组、阳性药(甲氨蝶呤)组、秦艽组、威灵仙组、秦威药对组、獐牙菜苦苷组、龙胆苦苷组和獐牙菜苷组。各组给予对应含药培养基干预24 h后,使用CCK-8试剂盒,上酶标仪检测细胞增殖活性,通过Graph Pad8.0软件统计分析。4.磷脂结合蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光橙红(Annexin V-FITC)细胞凋亡检测试剂盒检测给药后RA-FLSs的凋亡取对数生长期细胞,分组同上,给含药培养基干预48 h后,使用Annexin V-FITC试剂盒,上流式细胞仪检测细胞凋亡情况,通过Graph Pad8.0软件统计分析。5.酶联免疫吸附法(Elisa)检测给药后RA-FLSs培养上清液中类风湿因子(RF)和C反应蛋白(CRP)的含量取对数生长期细胞,分组同上,对各组细胞给含药培养基,处理24 h后,收集细胞培养上清液;使用Elisa试剂盒操作,上酶标仪检测细胞RF和CRP表达水平,通过Graph Pad8.0软件统计分析。6.分子对接技术对接重要成分与RA-FLSs核心靶点蛋白1)通过RCSB PDB数据库检索核心靶点蛋白结构;2)借助ZINC数据库Substances模块检索重要成分:獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷及阳性药(甲氨蝶呤)的3D化学结构;3)通过py MOL2.2.0软件去除靶点蛋白结构中的水分子和其他配体小分子后导入Mgltools1.5.6软件进行加氢,计算电荷,合并非极性氢处理等操作;4)通过Mgltools1.5.6软件处理成分结构;5)使用CMD命令字符运行Auto Dock Vina1.1.2进行分子对接。7.蛋白免疫印迹技术(Western Blot)检测RA-FLSs的蛋白表达情况采用Western Blot法半定量检测含药培养基处理后的各组RA-FLSs的核心蛋白Bcl-2、PPARD和c-Fos的蛋白表达情况,并借助Image J软件对其条带进行灰度分析,通过Graph Pad8.0软件统计分析。8.实时荧光定量聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测RA-FLSs的基因表达情况采用RT-PCR检测含药培养基处理后的各组RA-FLSs的核心靶点的Bcl-2 m RNA、PPARD m RNA和c-Fos m RNA的基因表达情况,通过Graph Pad8.0软件统计分析。结果:1.网络药理学分析结果共收集得到秦威药对含有獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷等活性成分11种,重要成分8个;秦威药对作用于RA的重要靶点有Bcl-2、PPARD和c-Fos等47个,核心靶点4个;涉及到类固醇激素合成、花生四烯酸代谢和药物代谢等生物过程8类,癌症通路、代谢途径通路和类固醇激素合成通路等重要信号通路13条。2.水煎液成分分析结果秦威药对水煎液中含有獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷三种通过网络药理学分析得到的重要成分,分别在0.0210~1.0560μg、0.0365~11.7200μg和0.0162~1.1420μg范围内线性关系良好;平均加样回收率分别为99.64%(RSD=2.33%,n=6)、100.20%(RSD=0.64%,n=6)和101.11%(RSD=3.59%,n=6);秦威药对水煎液中龙胆苦苷、獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的含量分别为28.36 mg·g-1、4.51 mg·g-1和2.13 mg·g-1。3.细胞增殖活性检测结果中药水煎液组方面,各给药组较空白组对RA-FLSs细胞增殖均具有显著抑制作用(P<0.01);与阳性药组比较,威灵仙组对细胞增殖抑制作用优于阳性药组(P<0.01),秦艽组弱于阳性药组(P<0.01);各中药组间比较,威灵仙组作用最强(P<0.01),秦威药对组次之(P<0.01),秦艽组最次(P<0.01)。重要成分组方面,各给药组较空白组对RA-FLSs细胞增殖均具有显著抑制作用(P<0.01);与阳性药组比较,獐牙菜苦苷组和龙胆苦苷组对细胞增殖抑制作用优于阳性药组(P<0.01);各重要成分组间比较,龙胆苦苷组作用最强(P<0.01),獐牙菜苦苷组次之(P<0.01),獐牙菜苷组最次(P<0.01)。4.细胞凋亡检测结果中药水煎液组方面,各给药组较空白组对RA-FLSs细胞均具有显著的促进凋亡作用(P<0.01);与阳性药组比较,各中药组的促细胞凋亡作用均弱于阳性药组(P<0.01);各中药组间比较,秦艽组的促进细胞凋亡作用最次(P<0.01,P<0.05);威灵仙组与秦威药对组比较无差异,作用相近。重要成分组方面,各给药组较空白组对RA-FLSs细胞均具有促进凋亡作用(P<0.01,P<0.05);与阳性药组比较,龙胆苦苷组的促进细胞凋亡作用优于阳性药组(P<0.01),而獐牙菜苷组弱于阳性药组(P<0.01),獐牙菜苷组与阳性药组比较无差异,作用相近;各重要成分组间比较,龙胆苦苷的促进细胞凋亡作用最佳(P<0.01),獐牙菜苷组次之(P<0.01),獐牙菜苦苷组最次(P<0.01)。5.RF和CRP检测结果中药水煎液组方面,各给药组细胞培养液中RF的含量较空白组均显著降低(P<0.01);与阳性药组比较,威灵仙组细胞培养液中RF的含量比阳性药组低(P<0.01);各中药组间比较,威灵仙组细胞培养液中RF含量最低,作用最强(P<0.01),秦艽组次之(P<0.01),秦威药对组最次(P<0.05)。各给药组的细胞培养液中CRP的含量较空白组均显著降低(P<0.01);与阳性药组比较无差异,作用相近;各中药组间比较无差异,作用相近。重要成分组方面,各给药组细胞培养液中RF的含量较空白组均显著降低(P<0.01);与阳性药组比较,獐牙菜苷组细胞培养液中RF的含量比阳性药组高(P<0.01);各重要成分组间比较,獐牙菜苦苷组和龙胆苦苷组细胞培养液中RF含量均比獐牙菜苷组低,作用强于獐牙菜苷组(P<0.01);獐牙菜苦苷组和龙胆苦苷组比较无差异,作用相近。各给药组细胞培养液中CRP的含量较空白组均显著降低(P<0.01);与阳性药组比较,龙胆苦苷组和獐牙菜苷组细胞培养液中CRP含量均比阳性药组高(P<0.01);各重要成分组间比较,獐牙菜苦苷组细胞培养液中CRP含量最低,作用最强(P<0.01);龙胆苦苷组和獐牙菜苷组间比较无差异,作用相近。6.分子对接结果Bcl-2方面,龙胆苦苷具有最佳的对接效果,龙胆苦苷结合能为-6.7 kcal/mol,通过GLN-190、THR-7、GLY-5和GLY-8位点的蛋白残基形成氢键作用于Bcl-2(1GJH)靶点蛋白。PPARD方面,獐牙菜苦苷具有最佳的对接效果,獐牙菜苦苷的结合能为-8.1 kcal/mol,獐牙菜苦苷和龙胆苦苷通过ASN-227、ASN-343和ALA-342位点的蛋白残基形成氢键作用于PPARD(3PEQ)靶点蛋白。c-Fos方面,龙胆苦苷具有最佳的对接效果,龙胆苦苷的结合能为-6.4 kcal/mol,通过ARG-141、ARG-156、ARG-164和GLY-142位点的蛋白残基形成氢键作用于c-Fos(1K6O)靶点蛋白。7.蛋白表达情况检测结果Bcl-2蛋白表达结果:中药水煎液组方面,各给药组(除秦威药对组)的Bcl-2蛋白表达水平较空白组显示出不同程度降低(P<0.01);与阳性药组比较,秦威药对组的Bcl-2蛋白表达水平比阳性药组高(P<0.01),抑制Bcl-2蛋白表达水平的作用弱于阳性药组;各中药组间比较,秦艽组和威灵仙组的Bcl-2蛋白表达水平均比秦威药对组低,作用较强(P<0.01,P<0.05),秦艽组和威灵仙组间比较无差异,作用相近。重要成分组方面,各给药组的Bcl-2蛋白表达水平较空白组显示出不同程度降低(P<0.01,P<0.05);与阳性药组比较,龙胆苦苷组的Bcl-2蛋白表达水平比阳性药组低(P<0.05),抑制Bcl-2蛋白表达水平的作用强于阳性药组;各重要成分组间比较,龙胆苦苷组的Bcl-2蛋白表达水平最低,作用最强(P<0.01);獐牙菜苦苷组和獐牙菜苷组间比较无差异,作用相近。PPARD蛋白表达结果:中药水煎液组方面,各给药组的PPARD蛋白表达水平较空白组显示出不同程度降低(P<0.01);与阳性药组比较,威灵仙组的PPARD蛋白表达水平比阳性药组低(P<0.01),抑制PPARD蛋白表达水平的作用强于阳性药组;各中药组间比较,威灵仙组的PPARD蛋白表达水平最低,作用最强(P<0.01);秦艽组和秦威药对组间比较无差异,作用相近。重要成分组方面,各给药组的PPARD蛋白表达水平较空白组显示出不同程度降低(P<0.01);与阳性药组比较,獐牙菜苦苷组的PPARD蛋白表达水平比阳性药组低(P<0.05),抑制PPARD蛋白表达水平的作用强于阳性药组;各重要成分组间比较,獐牙菜苦苷组的PPARD蛋白表达水平最低,作用最强(P<0.01);龙胆苦苷组和獐牙菜苷组间比较无差异,作用相近。c-Fos蛋白表达结果:中药水煎液组方面,仅有阳性药组、威灵仙组和秦威药对组较空白组的c-Fos蛋白表达水平显示出不同程度降低(P<0.01,P<0.05);与阳性药组比较无差异,作用相近;各中药组间比较,秦艽组和秦威药对组间比较无差异,作用相近;威灵仙组的c-Fos蛋白表达水平比秦艽组低(P<0.05),作用最强。重要成分组方面,各给药组(除獐牙菜苦苷组)的c-Fos蛋白表达水平显示出不同程度降低(P<0.01,P<0.05);与阳性药组比较,獐牙菜苦苷组的c-Fos蛋白表达水平比阳性药组高(P<0.05),抑制c-Fos蛋白表达水平的作用弱于阳性药组;各重要成分组间比较,獐牙菜苦苷组和獐牙菜苷组间比较无差异,作用相近;龙胆苦苷组的c-Fos蛋白表达水平比獐牙菜苦苷组低(P<0.01),作用最强。8.基因表达水平检测结果Bcl-2 m RNA表达结果:中药水煎液组方面,各给药组(除秦威药对组外)的Bcl-2 m RNA表达水平较空白组显示出不同程度降低(P<0.01);与阳性药组比较,威灵仙组的Bcl-2 m RNA表达比阳性药组低,但秦威药对组比阳性药组高(P<0.01,P<0.05),威灵仙组抑制Bcl-2 m RNA表达水平的作用强于阳性药组和秦威药对组;各中药组间比较,威灵仙组的Bcl-2 m RNA表达水平最低,作用最强(P<0.01),秦艽组次之(P<0.01),秦威药对组最次(P<0.01)。重要成分组方面,各给药组Bcl-2 m RNA表达水平较空白组显示出不同程度降低(P<0.01,P<0.05);与阳性药组比较无差异,作用相近;各中药组间比较无差异,作用相近。PPARD m RNA表达结果,中药水煎液组方面,仅有威灵仙组的PPARD m RNA表达水平较空白组具有一定程度降低(P<0.05),抑制PPARD m RNA表达水平的作用最强;与阳性药组比较无差异,作用相近;各中药组间比较无差异,作用相近。重要成分组方面,仅有獐牙菜苦苷组较空白组的PPARD m RNA表达水平具有一定程度降低(P<0.05),抑制PPARD m RNA表达水平的作用最强;与阳性药组比较无差异,作用相近;各中药组间比较无差异,作用相近。c-Fos m RNA表达结果,中药水煎液组方面,各给药组较空白组的c-Fos m RNA表达水平呈不同程度降低(P<0.01);与阳性药组比较无差异,作用相近;各中药组间比较无差异,作用相近。重要成分组方面,仅有阳性药组和龙胆苦苷组的c-Fos m RNA表达水平呈不同程度降低(P<0.01,P<0.05);与阳性药组比较,獐牙菜苷组的c-Fos m RNA表达水平比阳性药组高(P<0.05),抑制c-Fos m RNA表达水平的作用弱于阳性药组;各重要成分组间比较,龙胆苦苷组的c-Fos m RNA表达水平最低(P<0.01,P<0.05),作用最强;獐牙菜苦苷组和獐牙菜苷组间比较无差异,作用相近。结论:秦威药对可能是通过重要成分獐牙菜苦苷和龙胆苦苷作用于RA-FLSs,抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、减少RA-FLSs培养液中的RF和CRP,抑制Bcl-2、PPARD和c-Fos的蛋白表达以及Bcl-2 m RNA、PPARD m RNA和c-Fos m RNA的基因表达,最终达到治疗RA的目的。网络药理学在分析药物治疗疾病的机制方面具有可靠性。