论文部分内容阅读
【目的】子宫颈癌为世界范围内女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居第二(仅次于乳腺癌),78%的病例在发展中国家,为我国女性肿瘤死亡原因的第二位;子宫颈癌的治疗,原则上以手术及放射治疗为主,辅助与化疗;中晚期(Ⅱb-Ⅳ)目前则多以同步放化疗为主,但5年生存率约为50%。虽然放疗是子宫颈癌的主要治疗手段之一,但这些患者中仍有相当数量的患者5年内复发,约35%的宫颈浸润癌治疗后复发;如果能提高放射治疗的效果,就要研究宫颈癌的放射敏感性。研究表明,肿瘤患者对放疗的反应主要取决于其个体固有的放射敏感性,肿瘤本身固有的放射敏感性与辐射诱导的基因表达和基因调控有关,所以如果找到子宫颈癌放射敏感密切相关的基因,就可以更好的制定宫颈癌患者个体化治疗方案,减少复发。本实验培了3株不同病理类型不同分化的人宫颈癌细胞,使用不同剂的X线照射单次,分析其生存率的大小,以初步判断其放射敏感性和敏感程度;应用人类全基因组序列的寡聚核苷酸芯片来获得两个放射敏感性不同的宫颈癌细胞基因的变化,通过比较宫颈癌细胞株照射前后基因表达谱的改变,分析得到差异表达基因,并经过初步验证,希望找到宫颈癌放射敏感性相关的基因。【方法】培养3株人子宫颈癌细胞株Hela(腺癌)、Siha(低分化鳞癌)和Hcc94(高分化鳞癌),给于3株细胞单次不同剂量的6MV X线照射,剂量依次为为0、2、4、6、8、10Gy,可见宫颈癌细胞株照射前后发生的形态上变化;计算细胞的克隆形成率,使用SigmaPlot软件采用“多靶单击模型”来拟合剂量存活曲线,可以得到放射敏感性的指标:2Gy照射后细胞的存活分数(SF2)、参数外推值(N)、平均致死剂量(Do)等;使用流式细胞技术检测获得细胞X线照射前及照射后周期及凋亡细胞的比例,筛选出放射敏感差异细胞株。使用北京博奥生物有限公司的人类全基因组表达谱芯片检测6Gy X线照射前后敏感差异细胞株的基因表达谱,筛选照射前后的差异表达基因。通过分析X线照射前后细胞株的基因变化以获得由X射线引起的差异表达基因。随机挑选4个2倍以上的差异基因,使用相对实时定量荧光PCR验证芯片的基因改变,以确定芯片检测结果的是否可靠。【结果】照射后的子宫颈癌部分细胞呈凋亡改变,出现变圆及脱落;照射后的细胞培养继续培养约1421d,肉眼即可见细胞克隆。通过拟合剂量存活曲线可得到3株宫颈癌细胞的SF2值,Hela细胞株为0.725是最高,Siha细胞株为0.581,hcc94细胞为0.391,属于最低,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪分析,照射前Hela细胞G2/M期细胞比例为10.42%明显低于Hcc94细胞比例18.77%(P<0.05);6Gy X线照射后,G2/M期均明显阻滞,S期细胞比例也出现了下降。X射线照射后的24小时, Hela细胞G2/M期比例明显中高于Hcc94细胞(42.9%VS30.95%,P<0.05);且与照射前比较2株细胞凋亡率均有增加。分析基因芯片结果可见Hela细胞株照射后与照射前比较共有差异表达基因314条,其中上调的基因共有17条,下调的有297条;Hcc94细胞株照差异基因为111条;2倍上调基因72个,下调基因39个。通过分析筛选出的55条差异表达在两倍以上的基因,了解其分子功能。随机选择的4个2倍以上的差异基因,用相对RT-PCR技术检测其表达产物量,结果RT-PCR结果与芯片结果相符,证明芯片结果是可靠的。【结论】宫颈癌细胞株Hela细胞的放射敏感性最低,属于放射敏感细胞,Hcc94的放射敏感性最高,选择这两株细胞进行人全基因组表达谱芯片进行检测,通过分析得到了放疗引起的差异基因,这些差异基因涉及到DNA损伤以及修复,细胞凋亡及信号传导和周期调节等不同的分子功能分类,有些差异基因甚至参与多个过程。宫颈癌的放射敏感性可能与最后筛选得到的差异表达基因密切相关,尤其是在放射抵抗的Hela细胞株中明显上调的基因,有助于寻找宫颈癌放射敏感或耐受的基因,为放射治疗敏感性的提高并提供新的靶点及方法。