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食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,具有发病率高、发病隐匿、易转移和死亡率高等特点。目前治疗方法主要有手术、化疗、放疗等,对晚期食管癌患者不能手术治疗,且放疗、化疗疗效也不能令人满意。所以寻求食管癌治疗的新途径为研究热点之一。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种有效抑制肿瘤发生发展和浸润、转移的新的基因治疗方法。该方法是将双链RNA(double strand RNA,dsRNA)导入细胞内引起同源mRNA降解的一种细胞反应过程。dsRNA进入细胞后被特异性dsRNA核酸酶(Dicer)切割成多个21bp-25bp的短干扰RNA(short interfering RNAs,siRNAs),siRNAs与一些核酸酶结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),由RISC介导同源mRNA的降解,属于转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)的一种。可直接在体外大量合成,易于筛选有效序列,为构建RNAi重组载体奠定基础。自从1998年被发现以来,作为有力工具,RNAi技术已被用于大肠癌、肝癌、卵巢癌等多种人类肿瘤的研究,但应用其研究食管癌少见报道。乙酰肝素酶,又名肝素酶(heparanase,HPA)是一种能够降解硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)的糖苷内切酶,HS是糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)家族中的一个成员,是一种线性多聚糖,几条HS链与核心蛋白共价结合组成硫酸乙酰肝素糖蛋白(heparan sulfate proteoglycans,HSPGs),HSPGs是一类广泛存在于细胞表面、细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)中的糖蛋白,它与多种生物活性分子结合并相互作用,HPA对HSPGs的降解,改变了组织的完整性,并释放出生物活性分子,如碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factors,bFGF),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等,从而产生一系列的生物学现象如妊娠、炎症反应、血管生成等,促进肿瘤的侵袭和转移。本研究应用RNAi技术体内外特异性抑制食管癌细胞HPA表达,并采用免疫组化、原位杂交等技术检测RNAi抑制后HPA蛋白及mRNA在食管癌EC9706细胞、裸鼠食管癌抑制瘤组织中的表达情况,为临床应用RNAi技术对食管癌进行基因治疗提供理论依据。材料和方法1.食管癌EC9706细胞的培养:食管癌EC9706细胞以10%胎牛血清培养液(含青、链霉素各100u/ml)在37℃、5%CO2条件下贴壁培养。2.dsRNA的体外合成和鉴定:首先合成DNA模板,3′端为T7启动子序列,可在体外和T7 RNA聚合酶结合转录出目的dsRNA。应用4%琼脂糖凝胶电泳,以定量模板DNA为参照,测定dsRNA的长度和浓度。3.转染:应用LipofectamineTM 2000脂质体将dsRNA转染各组EC9706细胞。4.HPA RNAi体外抑制实验:采用浓度为10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L体外合成的HPA siRNA转染EC9706细胞24h、48h、72h,另设无关序列组及不转染组作为对照。5.HPA RNAi体内抑制实验:①先转染后成瘤:采用浓度为20μmol/L体外合成的siRNA转染EC9706细胞72h,另设无关序列组及不转染组。然后种植于裸鼠皮下构建裸鼠食管癌移植瘤动物模型;②先成瘤后转染:构建裸鼠食管癌移植瘤模型,待肿瘤长出1W后,依3μg/只/次腹腔注射siRNA及无关序列,连续3d,另1组仅注射PBS作空白对照,6.转染后检测:采用免疫组化、原位杂交等方法检测转染后的EC9706细胞及裸鼠食管癌移植瘤中HPA蛋白及mRNA表达情况。7.统计学处理:应用SPSS10.0统计软件进行统计学处理,资料用均数±标准差((?)±S)表示;多组均数的比较用方差分析,方差不齐时先进行变量转换。显著性水准a=0.05。结果1.成功体外合成两条HPA siRNA,长度为21bp。2.免疫细胞化学结果:10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L 3种不同浓度特异HPA siRNA转染食管癌EC9706细胞24h、48h、72h后,HPA蛋白表达量均较对照组有所降低,以20μmol/L转染72h的抑制效应最为明显,3种浓度两两相比,差异均无统计学意义(P>0.05),每个时间段内随剂量增加siRNA抑制效应均增强,3种浓度两两相比,差异均有统计学意义(P<0.05),无关序列对照组及不转染组(空白对照组)均未表现出对HPA蛋白表达的抑制效应。各实验组与无关序列对照组及空白对照组两两相比,差异均有统计学意义(P<0.01=。3.原位杂交结果:10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L三种不同浓度特异HPA siRNA转染食管癌EC9706细胞24h、48h、72h后,HPA mRNA表达量均较对照组有所降低,同样以20μmol/L转染72h的抑制效应最为明显,3者两两相比,差异均无统计学意义(P>0.05),每个时间段内随剂量增加siRNA抑制效应均增强,3者两两相比,差异均有统计学意义(P<0.05),无关序列组及不转染组均未表现出对HPA mRNA表达的抑制效应。各实验组与无关序列对照组及空白对照组两两相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。4.HPA siRNA体外转染食管癌EC9706细胞24h、48h、72h后,其对HPA蛋白表达的抑制效应和对HPA mRNA表达的抑制效应,呈正相关关系(P<0.05)。5.裸鼠体内实验结果:①先转染后成瘤组:浓度为20μmol/LHPA siRNA可下调裸鼠食管癌移植瘤组织中HPA蛋白及mRNA的表达,与无关序列组及空白对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);②先成瘤后转染组:浓度为20μmol/L HPA siRNA亦可下调裸鼠食管癌移植瘤组织中HPA蛋白及mRNA的表达,与无关序列组及PBS空白对照组相比,差异均有显著性(P<0.05)。①中siRNA的抑制效应较②稍弱,但两者相比,差异均无统计学意义(P<0.05)6.无论是先转染后成瘤组或是先成瘤后转染组,HPA RNAi对裸鼠食管癌移植瘤组织中HPA蛋白和对其mRNA表达影响呈正相关关系(P<0.05,先转染后成瘤组r=6.87;先成瘤后转染组r=7.04)。结论1.应用体外转录系统可成功合成dsRNA。2.体外采用不同浓度的HPA siRNA转染EC9706细胞后,EC9706细胞中HPA蛋白及mRNA表达均受到一定程度的抑制,同时HPA dsRNA可有效体内抑制裸鼠食管癌移植瘤组织中HPA蛋白及mRNA表达,提示HPA siRNA可通过特异性抑制HPA mRNA表达从而抑制HPA蛋白表达,进而抑制食管癌或其它恶性肿瘤的浸润转移。3.先转染后成瘤组及先成瘤后转染组中,HPA siRNA均对裸鼠食管癌移植瘤组织中HPA蛋白及mRNA表达有抑制作用,表明体内应用RNAi技术沉默目的基因具有可行性。4.先成瘤后转染组HPA siRNA沉默HPA基因表达能力强于先转染后成瘤组,且前者更接近临床,此研究结果为临床应用RNAi技术治疗恶性肿瘤奠定了一定的理论基础。