木芙蓉黑斑病及其内生拮抗菌生防作用研究

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木芙蓉(Hibiscus mutabilis)又名芙蓉花、拒霜花,为锦葵科、木槿属的落叶灌木或小乔木,由于木芙蓉树形饱满、叶片舒展、花色各异,所以常被作为园林植物应用广泛种植于中国各大城市,观赏价值高。其花叶也为中医常见药材而深受大众青睐,具有很高的商业价值。近年来,木芙蓉叶部病害严重发生,严重影响植株的生长发育与园林观赏性,造成巨大经济损失。然而目前国内外关于木芙蓉叶部病害的研究甚少,病害种类也鲜有报道,其叶部病害有关防治技术的研究更是十分匮乏,并且目前多以化学防治为主,对环境也会造成污染。本研究以患有黑斑病的木芙蓉叶片为研究对象,以常规的组织分离法对木芙蓉叶黑斑病的病原菌进行分离、鉴定,并探索其生物学特性,在此基础上从健康叶面微生物区系中筛选出内生生防细菌,分析其抗菌物质,并通过盆栽试验验证其防治效果,为木芙蓉病害无公害治理提供理论依据。(1)首次发现木芙蓉叶黑斑病新病原,柯赫氏法验证其致病性。以通用真菌试剂盒提取目标真菌DNA,基于通用引物ITS1/ITS4、ITS4/ITS5及特异性引物翻译延伸因子和β微管蛋白对新病原真菌DNA进行扩增后进行测序和对比分析。结果表明,致病菌株平板培养初期形成洁白、发达、湿润的放射状菌丝,产孢后,菌落底部为墨绿色、边缘规则、有清淡气味,显微观察表明其菌丝有分支、有隔,孢子黑褐色、近球形,平均直径13.2μm-14.5μm。四种引物测序结果分别输入NCBI数据库的Genbank中进行对比分析,确定该病害病原为稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)。(2)木芙蓉叶黑斑病新病原生物学特性研究包括最适温度、最适p H、最适光照条件、最适氮源、最适碳源、最适培养基种类和致死温度。结果表明,木芙蓉叶黑斑病病原菌最适生长温度为28℃左右,最适p H6-7,最适光照条件为全光照,最适氮源、碳源分别为硫酸铵和甘露醇,最适培养基类型为燕麦培养基(OMA),其致死温度为54℃。(3)筛选出有生防潜力的内生抗生菌。选木芙蓉健康叶片经表面灭菌后分离纯化细菌,以平板对峙法确定有拮抗作用的菌株并对其分子生物学鉴定,16S r DNA序列结果在NCBI的Gen Bank数据库中比对分析,确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。以平板对峙法进行拮抗实验得出拮抗菌的拮抗率为61.4%,硫酸铵盐析法研究解淀粉芽孢杆菌代谢物发现,当硫酸铵饱和度在50%时,可获得对稻黑孢菌具有抑制作用的粗蛋白。盆栽实验表明,未喷施解淀粉芽孢杆菌菌悬液的木芙蓉发病率达到98.77%,病情指数达到72.18,随着解淀粉芽孢杆菌菌悬液稀释倍数的增加,木芙蓉黑斑病发病率与病情指数的值随之增加,防治效果逐渐降低,而解淀粉芽胞杆菌对木芙蓉黑斑病的防效与不同处理方式有关,生防菌预先处理防效最好,生防菌病原同时接种次之,病原先接种防效较差。解淀粉芽孢杆菌对木芙蓉黑斑病有明显防预防作用,病害发生后的生防效果不理想。解淀粉芽孢杆菌菌悬液的50-200倍液预防效果达到80%以上,最高可达91.22%。
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