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微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类长约22个核苷酸的非编码单链小RNA分子,能与靶基因的mRNA 3’端非翻译序列完全或部分互补结合,导致靶mRNA降解或翻译抑制,在转录后水平上调控靶基因的表达。miRNA进化上高度保守,它们不具有开放阅读框,不编码蛋白质,但却参与机体的各种重要的生理和病理过程。最近的研究发现,miRNA在神经系统中的表达方式呈现高度的进化保守性、表达时序性和组织特异性,miRNA在脊椎动物脑中含量丰富,在神经系统的发育及可塑性中发挥重要作用,并且与神经系统有关疾病的发生发展有着密切关系。我们实验组最近研究发现,来自于食物中的外源的植物miRNA在被动物口服之后,能够不被降解,而完整地经由消化道吸收从而进入外周血和组织器官中,并有可能发挥其相应的生物学功能。但是,这其中miRNA的具体吸收转运机制仍然不清楚。本论文主要从miRNA在神经系统中调控神经元凋亡的功能以及哺乳动物对于外源miRNA的吸收机制两个方面进行研究。论文第一部分开展了神经系统发育过程中以及疾病应激状态下miRNA调控Apaf-1进而调节神经元凋亡的研究。我们首先通过Western blot技术和RT-PCR技术发现小鼠大脑皮层的Apaf-1的表达随着发育进程逐步下降,其中蛋白的变化比mRNA的变化剧烈得多,并通过免疫组化方法验证了 Apaf-1蛋白的降低;结合生物信息学预测结果,我们发现四个miRNA(miR-23a,miR-23b,miR-27a,miR-27b)在Apaf-1的3’-UTR上有保守的结合位点,并通过qRT-PCR技术证实小鼠大脑皮层的miR-23-27 clusters的表达逐渐上升,与Apaf-1的表达变化呈现负相关,我们利用dot blot技术和原位杂交技术验证了上升最显著的miR-23b的变化;进一步通过Luciferase实验和Westernblot实验发现,miR-23a/b和miR-27a/b确实能够转录后水平抑制Apaf-1的表达;我们进一步发现,在病理状态下,缺氧刺激可以诱导皮层神经元的凋亡,降低miR-23b-27b的表达以及提高Apaf-1的表达;随后,我们在体外培养的原代神经元中过表达miR-23b和miR-27b,发现Apaf-1表达受到抑制,从而减少了缺氧诱导的神经元的凋亡;通过对构建的过表达miR-23b-27b的转基因小鼠进行研究,发现胚胎期小鼠皮层神经元中miR-23b-27b高表达,通过抑制Apaf-1表达从而使得缺氧导致的神经元凋亡率降低。论文第二部分开展了胎儿宫内窘迫模型中转录因子c-Myc抑制miR-23b/27b的转录进而影响神经元凋亡的研究。根据前期研究和进一步实验,我们发现小鼠的大脑皮层和体外培养的神经元在经过缺氧刺激后,其中的miR-23b和miR-27b的成熟体和初级转录本的表达都会下调;与此同时,通过Westernblot和qRT-PCR实验发现,c-Myc的表达在缺氧刺激后上调;接着,我们进一步在原代培养的神经元中过表达c-Myc,发现miR-23b和miR-27b的成熟体和初级转录本表达都显著性下降;相反地,我们利用针对c-Myc蛋白的特异性siRNA来干扰降低神经元中c-Myc的表达,发现miR-23b和miR-27b的成熟体和初级转录本表达都显著性上升,c-Myc负向调节miR-23b和miR-27b的表达水平;我们进一步通过ChIP实验和Luciferase实验来验证c-Myc与miR-23b-27b cluster的启动子区域的E-box结合;最后,我们发现,缺氧环境下,干扰降低c-Myc的表达可以通过提高miR-23b-27b的表达,抑制Apaf-1的表达,最终能够降低神经元的凋亡率。论文第三部分开展了 SIDT1介导外源miRNA转运进入哺乳动物体内的研究。我们发现,人源细胞系中绝大多数都有SIDT1的表达并定位于细胞膜表面,小鼠各组织都有SIDT1的表达分布,其中胃组织中表达最高;通过实验发现,细胞可以自发摄取外源的双链miRNA以及能形成双链结构的二聚体的单链miRNA;进一步的研究表明,干扰降低SIDT1的表达会导致细胞摄取外源miRNA的能力降低;通过构建SIDT1基因敲除小鼠研究发现,SIDT1蛋白敲除使得小鼠吸收外源miRNA的能力显著性降低,包括外源人工合成的miRNA以及食物中天然存在的miRNA;总而言之,我们发现,SIDT1在介导外源miRNA转运进入哺乳动物体内的过程中发挥了重要的作用。综上所述,本论文分别从miRNA在神经系统中发挥的功能以及哺乳动物对于外源miRNA的吸收机制两个方面进行研究。一方面,我们发现,生理条件和病理条件下,miRNA(miR-23-27)可以通过靶向凋亡相关蛋白Apaf-1进而影响神经元凋亡,并且缺氧刺激下miR-23b和miR-27b的变化是由转录因子c-Myc在转录水平进行调控的,该研究有助于人们对miRNA在神经系统中发挥的作用有更深入的了解;另一方面,我们发现,SIDT1参与了外源miRNA经过动物消化吸收通过胃肠道转运进入动物体内,该研究首次阐明了外源miRNA转运进入动物体内跨界调控动物基因的内在吸收机制。