研究背景:化学治疗是恶性肿瘤主要治疗手段之一,但绝大多数化疗药物(包括顺铂、蒽环类、抗细胞微管剂、烷化剂、抗代谢类及分子靶向药物)都具有严重毒副作用,特别是心脏毒性,表现为患者出现胸闷、心悸、心前区不适、气短等症状,甚至损害心肌细胞出现心力衰竭。心电图也会出现改变,如T波低平或ST段压低等。其中顺铂和阿霉素均对心脏有较强的毒性,表现有心电图改变,如心脏节律和速率的改变,出现期前收缩以及ST段或T波的升高或降低,长期的心脏损害可导致急性或慢性的心力衰竭,这些改变难以逆转,可直接或间接导致患者死亡,预后差。Apelin是由脂肪细胞分泌的一种具有生物活性的肽类激素,人Apelin基因位于染色体Xq25-26.3,分子量为12876,包含2个内含子和3个外显子,其mRNA长度为3125bp。Apelin的受体APJ是由380个氨基酸组成并含有7个螺旋跨膜结构的G蛋白偶联受体。Apelin具有正性肌力与心脏保护以及降低血压等心血管效应,此外还有行为调节、体温调节、免疫和电解质平衡调节作用,甚至可作用于脂肪—胰岛素轴发挥不同的生物学效应。以铂类为基础的化疗是对抗人类癌症最有效的方法之一,其中顺铂以其高效、广谱的优点在临床上应用广泛。然而,在其治疗肿瘤的同时也伴随着严重的心脏毒性,降低铂类化疗副作用的需求尤为迫切。本研究通过检测Apelin-13和(或)顺铂对大鼠体外H9c2心肌细胞和C57小鼠作用的实验,评估Apelin-13对顺铂心脏毒性的作用,发现Apelin-13能够缓解顺铂导致的H9c2心肌细胞活性降低,Apelin-13合并治疗可以通过抑制心肌细胞凋亡显著减弱顺铂诱导的心脏毒性,并且能改善小鼠心脏血管新生。研究目的:鉴于顺铂治疗产生的明显的心脏毒性以及Apelin-13在心脏保护和降低血压等心血管效应的正性作用,本研究拟在细胞和机体两方面,从细胞活性和细胞凋亡等角度,探究Apelin-13对顺铂诱导的心肌细胞损伤的保护作用,评估Apelin-13在缓解顺铂诱导的心脏毒性中的作用。研究方法:1、MTT检测Apelin-13干预前后顺铂对H9c2大鼠心肌细胞的活性影响。首先单独给予H9c2大鼠心肌细胞不同浓度的Apelin-13,观察Apelin-13对细胞是否有毒性作用及Apelin-13对细胞活性的影响;然后再单独给予不同浓度的顺铂观察顺铂对细胞的毒性作用及对细胞活性的影响;最后联合给予相应浓度的Apelin-13和顺铂,观察H9c2大鼠心肌细胞的活性变化,给予评估Apelin-13抑制顺铂诱导的心肌毒性效果。2、流式细胞检测技术分析Apelin-13干预前后顺铂诱导的H9c2大鼠心肌细胞的凋亡情况,研究Apelin-13在顺铂介导的心肌细胞凋亡中的作用。3、免疫荧光检测Apelin-13和(或)顺铂混合处理大鼠心肌细胞时caspase-3的活性,Westernblot 方法检测 PARP、Caspase-3、Caspase-7 和 Caspase-9 活性,研究Apelin-13缓解顺铂诱导的心脏毒性的可能机制。4、最后,建立小鼠顺铂攻毒模型,随机分为空白对照组、顺铂组(20mg/kg)Apelin-13 组(10 μg/kg/d)及混合给药组(顺铂 20 mg/kg+Apelin-13 10 μg/kg/d),按既定方案给予腹腔注射给药14天,小鼠处死采集标本。测定了小鼠的体重和心脏重量水平,病理组织学检测Apelin-13干预前后小鼠心脏组织学的变化,从小鼠机体进一步评估Apelin-13在缓解顺铂诱导的心脏毒性中的作用。研究结果:1、Apelin-13在体外处理H9c2细胞,无任何细胞毒性。其中,50-600 nM可有效促进H9c2细胞的生长,表现为细胞活性的升高;顺铂可剂量依赖抑制H9c2心肌细胞生长,表现为细胞活性降低;细胞形态表现出相应的凋亡特征:如细胞皱缩、细胞数量减少、有凋亡小体形成等;Apelin-13预处理可显著减弱顺铂对H9c2细胞的抑制,细胞形貌也表现出显著的改善。2、顺铂处理诱导了显著的心肌细胞凋亡,表现为Sub-G1峰升高、caspase-3活性显著升高、PARP切割、caspase-3,7,9活化;Apelin-13预处理显著减弱了顺铂诱导的H9c2细胞凋亡,表现为Sub-G1峰降低、PARP切割减弱、caspase-3,7,9活性减弱。3、小鼠经顺铂处理显著降低了小鼠心脏重量,诱导了心肌细胞凋亡和抑制了血管生成,表现为活性caspase-3表达增加和CD34表达减少;Apelin-13联合治疗可显著抑制顺铂诱导的心脏重量减少,减轻顺铂诱导的心肌细胞凋亡和改善小鼠心脏内血管生成。研究结论:1.顺铂在体外可启动线粒体介导的凋亡,抑制H9c2心肌细胞的生长;Apelin-13在体外可抑制顺铂诱导的心肌细胞凋亡,减弱顺铂诱导的心肌毒性。2.Apelin-13体内可抑制顺铂诱导的心肌细胞凋亡,改善心脏血管生成。研究背景:铂类作为广谱细胞毒性抗肿瘤药物具有显著的临床疗效,以顺铂为代表的铂类化疗药是对抗人类癌症最有效的方法之一。但同时顺铂也具有明显的心脏毒性,目前顺铂导致心脏毒性的具体机制尚不清楚。然而,铂类可造成心功能不全、心动过缓、心绞痛、急性心肌梗死和心律失常等心脏毒性,其不仅严重限制了其临床应用,也增加了肿瘤生存患者出现心血管疾病的风险。有关研究表明,氧化应激在铂类化疗药物诱导的心脏毒性的病理过程中起着至关重要的作用,其可能会导致ROS的产生,促进ROS和丙二醛(MDA)的形成,加剧氧化应激。据悉,Apelin-13生物活性肽具有清除自由基的能力,并具有调节心血管系统的能力。通过Apelin-13对顺铂的心脏毒性作用潜力评估发现,经过Apelin-13预处理后减少了顺铂诱导的ROS和超氧阴离子生成,抑制了 DNA的损伤以及PARP的切割和Caspase的活化。进一步的研究表明,Apelin-13可通过MAPKs和PI3K/Akt信号通路的调控阻断顺铂诱导的H9c2心肌细胞凋亡。在本研究中,顺铂处理显著诱导了 H9c2心肌细胞内ROS和超氧阴离子的积累,提示氧化应激与顺铂毒性密切相关。本研究首先探讨了 MAPKs/Akt通路在Apelin-13保护顺铂诱导的心肌损伤中的作用,从而通过大鼠心肌细胞系验证Apelin-13在抑制氧化应激介导的DNA损伤,以及调节MAPKs/Akt通路保护顺铂诱导的心肌细胞毒性中的作用。研究目的:前文已证实Apelin-13具有缓解顺铂暴露所致的心肌细胞凋亡和损伤的作用,为进一步探究其潜在的作用机制,本研究从氧化应激的角度研究顺铂暴露介导的DNA损伤的缓解机制,分析MAPKs/Akt通路在Apelin-13拮抗顺铂诱导的心肌细胞损伤中的作用,进而为揭示Apelin-13对顺铂毒性保护作用的机制,为Apelin-13的临床应用提供理论基础。研究方法:1、为进一步探索Apelin-13缓解顺铂暴露所致的心肌细胞凋亡和损伤的作用机制,本研究首先检测了活性氧和超氧阴离子介导的氧化应激,及其导致的DNA损伤以及凋亡分子的变化,研究Apelin-13在保护心肌细胞抵御顺铂毒性中的作用。2、给予Apelin-13和顺铂刺激后,应用彗星试验检测药物处理后造成的DNA单链断裂情况,观察Apelin-13是否可能通过抑制ROS积累抑制顺铂诱导的DNA损伤发生。3、给予顺铂、Akt抑制剂(ly2294002)和ERK抑制剂(U0126)刺激后,通过MTT检测干预前后药物对H9c2大鼠心肌细胞是否有毒性作用及对细胞活性变化影响,评估Akt和ERK在顺铂诱导的心肌毒性中的作用。4、给予 Apelin-13、顺铂、Akt 抑制剂(ly2294002)和 ERK 抑制剂(U0126)刺激后,通过 Western Blot 方法检测 Apelin、APJ、ATM、ATR、Total-p53、ser15-p53、H2A、Akt、JNK、p38和ERK等相关蛋白分子的表达,分析MAPK和PI3K/Akt信号通路各分子的变化,研究Apelin-13在保护心肌细胞拮抗顺铂毒性损伤中的分子生物学机制。研究结果:1、顺铂诱导了 H9c2细胞内活性氧和超氧阴离子的产生,进而引起了 DNA损伤,表现为DNA损伤通路蛋白激活和DNA的单链断裂,如ATM、ATR、ser15-p53和H2A磷酸化的激活;Apelin-13的预处理显著抑制了顺铂诱导的ROS和超氧阴离子的产生,减弱DNA损伤和DNA的单链断裂,表现为DNA损伤信号分子磷酸化的减弱。2、顺铂处理显著抑制Apelin和APJ的表达,同时扰乱了 MAPKs和Akt通路的表达,表现为p-p38、p-JNK的激活及p-ERK、p-Akt的失活；然而,Apelin-13预处理有效抑制了顺铂对Apelin和APJ表达的抑制,减弱了顺铂对MAPKs和Akt通路蛋白表达的影响。研究结论:1、顺铂可通过诱导活性氧自由基的产生,激活DNA损伤,通过影响MAPKs和Akt信号通路的表达诱导心肌毒性和心肌细胞凋亡。2、Apelin-13可通过抑制氧化应激介导的DNA损伤和调控MAPKs和Akt信号通路抑制顺铂诱导的心肌毒性和心肌细胞凋亡。3、本研究为Apelin-13作为新的心肌保护药物的临床应用提供了理论基础,未来可能是一个有效的缓解化疗副作用的策略。