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第一部分构建非小细胞肺癌H1299 mtDNA缺失细胞模型及检测放射生物学改变目的：放射治疗是非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)的主要治疗方式之一,然而放射抗拒可导致放射治疗失败。目前,关于线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)与放射敏感性的关系的结论仍然不统一。本实验拟建立人肺癌H1299细胞mtDNA缺失模型(ρ0细胞),研究其放射生物学变化,探索mtDNA缺失与放射敏感性之间的关系。方法：用含微量溴化乙锭(EB)的特殊培养液持续培养正常的H1299细胞(p+),待克隆形成后采用有限稀释法获得mtDNA稳定缺失的p0细胞,将得到的ρ0细胞给予不含丙酮酸钠及尿苷的培养液培养进行生长缺陷鉴定,并提取ρ0细胞总DNA,采用特异性核DNA (nuclear DNA, nDNA)及mtDNA引物进行PCR鉴定该细胞模型。采用克隆形成实验检测细胞放射敏感性变化；ATP检测试剂盒检测照射组及非照射组细胞内ATP水平；DCFH-DA氧化敏感荧光探针检测照射组及非照射组细胞内活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)变化情况；流式细胞仪检测细胞周期及凋亡变化；Western blotting检测细胞周期相关蛋白ATM/ATR/CCNB1表达水平；共聚焦荧光显微镜检测反应DNA损伤的yH2AX灶点。结果：成功建立H1299ρ0细胞模型,克隆形成实验显示H1299ρ0较ρ+细胞放射敏感性降低,SF2分别为0.788±0.058 vs.0.525±0.072, P<0.05; D0分别为2.993±0.028 vs.2.119±0.012, P<0.05; Dq分别为3.601±0.015 vs.0.983±0.033,P<0.05。非照射组H1299ρ0及ρ+细胞ATP浓度分别为54.108±11.652umol/L vs. 87.428±7.222umol/L, P<0.05,2Gy照射后6h分别为17.964±5.225umol/L vs. 28.240±6.313umol/L, P<0.05, ρ0细胞放射照射前后ATP浓度均较低。非照射组H1299ρ0及ρ+细胞ROS平均荧光强度分别为49.953±3.86 vs.54.509±5.35, P>0.05,无显著差异。4Gy射线照射后30min细胞内ROS水平均显著升高,分别为66.174±6.26 vs.84.579±9.47,P<0.05,二者荧光强度增加比分别为16.220±2.399vs.30.070±4.12, P<0.05, ρ0细胞ROS升高水平明显低于p+细胞。H1299ρ+及p0细胞分别于放射照射后12h vs.24h G2/M期阻滞达到高峰,G2/M期细胞分布比例分别为48.100±3.691 vs. 37.416±2.105,P<0.05,ρ0较ρ+细胞G2期周期阻滞延长,调控细胞周期由G2/M向G1期转化的蛋白ATM/ATR/CCNB1表达增加。H1299ρ0及p+两组细胞自发性凋亡水平无显著区别,凋亡率分别为2.35+0.378 vs.3.175±0.512,P>0.05。但放射诱导的凋亡水平均有所增高,凋亡率分别为5.716±1.183 vs.12.75±2.523, P<0.05, ρ0细胞凋亡升高水平明显低于p+细胞。H1299ρ0和ρ+两组细胞自发性DSBs较少,yH2AX平均灶点数分别为10±5.215,11+3.741个,P>0.05。2Gy照射后30min, H1299ρ0和p+细胞DSBs迅速增加,yH2AX平均灶点数分别为18±2.408 vs.24±5.639个, P<0.05,表明H1299ρ0细胞DNA损伤修复明显加快。结论：低剂量EB诱导培养可成功建立mtDNA缺失的H1299ρ0细胞模型。mtDNA缺失的H1299ρ0细胞表现为放射敏感性降低,ATP及ROS产生减少,细胞周期G2/M期阻滞延长及凋亡抑制,细胞DNA损伤修复加快。第二部分：不同放射敏感性非小细胞肺癌H1299p0及p+细胞差异基因表达及生物信息学分析目的：我们在第一部分研究发现mtDNA缺失的非小细胞肺癌H1299ρ0细胞放射敏感性降低,但其具体机制尚不明确。本实验拟通过人表达谱基因芯片筛选线粒体-核逆向信号(retrograde signaling, RTG)通路在不同放射敏感性的p。及p+细胞之间的显著性差异表达基因,并进行生物信息学分析。方法：以H1299ρ0及p+为研究模型细胞,提取总RNA,质量鉴定合格后行荧光标记；采用Agilent人全基因组表达谱芯片(该芯片汇总目前所了解的人类全基因组序列信息,代表了超过41,000人类基因和转录本)进行杂交实验,获得mRNA表达谱；以Gene Spring Software 11.0软件和Quantile算法分析芯片实验数据,筛选出不同放射敏感性的p0及p+细胞之间的差异mRNAs;基于Gene Ontology数据库进行GO注释,基于KEGG数据库进行Pathway注释。结果：本研究获得符合基因芯片实验质量标准的RNA样品,采用Agilent人全基因组表达谱芯片检测了H1299ρ0和p+细胞之间差异基因表达谱(差异倍数fc≥3,P<0.05),共获得了2659个显著性差异基因,其中上调表达1499个mRNAs,下调表达1160个mRNAs。将上述筛选的差异表基因基于Gene Ontology数据库进行GO注释,生物学途径富集分析主要涉及细胞粘附、细胞生物学过程及其调节、物质转运、刺激反应、细胞生长及死亡、免疫应答等多个方面。下调的主要表现为典型的线粒体功能部分,如ATP合成、电子传递、氨基酸代谢、TCA循环及核糖核蛋白复合体中的基因,而DNA修复、胞质核糖体及线粒体表面折叠蛋白基因表达升高,即上调的主要为负责DNA修复、调节线粒体蛋白表达和运输。差异表达基因基于KEGG数据库进行Gene to pathway分子注释,差异显著性的信号通路主要涉及肿瘤信号通路、粘附、钙信号传导通路、受体配体途径、PPAR信号通路、物质代谢、MAPK信号通路、细胞因子等。mRNA水平验证部分差异倍数较大的感兴趣基因显示AKT2、mTOR、IKKs、CCNB1表达升高,而DBT及BAX降低,与基因芯片结果一致。结论：应用表达谱基因芯片技术获得了不同放射敏感性的ρ0及ρ+细胞之间RTG通路显著性差异基因,生物信息学分析显示细胞内发生广泛的病理性改变,且典型的线粒体功能部分下调,而负责DNA修复、调节线粒体蛋白表达和运输的基因上调。mRNA水平验证显示核基因编码AKT2、mTOR、IKKs及CCNB1表达升高,DBT及BAX表达降低,表明mtDNA对维持细胞的正常功能发挥重要作用,功能障碍的线粒体有可能通过转录因子NF-KB调节的逆向信号通路调节核基因PI3K/AKT2/mTOR通路的表达,引起细胞凋亡抗拒及周期阻滞,导致肿瘤细胞放射抗拒。第三部分：非小细胞肺癌H1299p0细胞线粒体-核逆向信号调控肺癌放射敏感性的机制探讨目的：研究mtDNA缺失后RTG通路显著性差异基因与放射敏感性之间的关系,阐明RTG通路调控放射敏感性的可能机制,探讨可能的放射增敏干预靶点。方法：在基因芯片研究结果的基础上,以H1299p0及p+细胞为研究对象,采用Western bloting法检测6Gy X放射线联合AKT2蛋白抑制前后,RTG信号通路NF-KB/PI3K/AKT2/mTOR及其上下游相关蛋白表达水平变化。结果：6Gy X放射线照射后H1299p0细胞逆向信号通路NF-KB/PI3K/AKT2/mTOR中AKT2、mTOR及IKBa基因的磷酸化蛋白水平升高,同时该通路上游蛋白HIF-1α及下游蛋白Bcl-2/BAX表达水平也升高。细胞放射照射前1h加入浓度为1umol/L的AKT2抑制剂-MK-2206,射线照射后1h检测显示NF-KB/PI3K/AKT2/mTOR信号通路中AKT2、mTOR及IKBa磷酸化蛋白水平均降低,通路下游促凋亡因子pro-Caspase3表达增加。结论：mtDNA缺失的H1299细胞中逆向信号通路NF-KB/HIF-1α/PI3K/AKT2/mTOR的表达增加与肿瘤细胞放射抗拒密切相关,通路中重要的信号分子AKT2可能是肺癌放射增敏的潜在靶标。