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目的:本实验旨在探讨铁皮石斛多糖对核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导的BMMs体外向破骨细胞分化的影响。
方法:使用水提醇沉法从铁皮石斛研磨物提取石斛多糖；通过M-CSF诱导的方式培养C57BL/6小鼠骨髓巨噬细胞BMMs，将浓度分别为0、25、50、100、200μg/ml的石斛多糖与骨髓巨噬细胞(BMMs)共培养12h，24h，48h，72h，用CCK8法检测石斛多糖对小鼠BMMs的增殖和细胞活力的影响；通过核因子κB受体活化因子配体(RANKL)与不同浓度石斛多糖和骨髓巨噬细胞共培养，于第5天进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)染色，分析石斛多糖对于RANKL诱导的体外破骨细胞形成的影响；收细胞总蛋白，通过Westernblot实验分析石斛多糖对于破骨细胞形成的影响机制，分别在1,3,5天收集RNA，通过RT-PCR检测石斛多糖对于破骨细胞相关基因表达的影响；数据通过SPSS19.0软件进行统计分析，结果表示为均数±标准差((x)±s)，当P＜0.05时数据有统计学意义。
结果:M-CSF诱导的成熟骨髓单核细胞呈现扁圆形，具有伪足，利用水提醇沉法提取石斛多糖，浓度低于200μg/ml的石斛多糖对于BMMs的增殖无明显影响，当浓度达到400μg/ml时，其对BMMs会产生明显抑制作用，p＜0.05，差异就有统计学意义；Westernblot：通过不同浓度的石斛多糖作用于RANKL诱导的破骨细胞分化，检测破骨细胞活化中通路的相关蛋白，NFATc1，C-fos，P38，P-P38，P65，P-P65，以Actin作为内参，结果显示石斛多糖抑制了NFATc1，C-Fos蛋白的表达，降低了P65和P38的磷酸化水平，而且表现出了一定的剂量依赖性；RT-PCR：相较于阴性对照组，RANKL诱导组和石斛组破骨细胞相关基因均上调，但是石斛组相关基因表达显著低于纯RANKL组，且具有一定的剂量依赖，P＜0.05，差异具有统计学意义；抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示，RANKL诱导组可见体积相对较大，细胞核数目＞10的破骨细胞形成，高浓度石斛多糖组破骨细胞形成受到抑制，仅形成少数体积很小的不成熟破骨细胞。
结论:铁皮石斛多糖通过抑制破骨细胞相关基因和相关通路蛋白的合成，抑制RANKL诱导的BMMs的破骨细胞分化。
方法:使用水提醇沉法从铁皮石斛研磨物提取石斛多糖；通过M-CSF诱导的方式培养C57BL/6小鼠骨髓巨噬细胞BMMs，将浓度分别为0、25、50、100、200μg/ml的石斛多糖与骨髓巨噬细胞(BMMs)共培养12h，24h，48h，72h，用CCK8法检测石斛多糖对小鼠BMMs的增殖和细胞活力的影响；通过核因子κB受体活化因子配体(RANKL)与不同浓度石斛多糖和骨髓巨噬细胞共培养，于第5天进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)染色，分析石斛多糖对于RANKL诱导的体外破骨细胞形成的影响；收细胞总蛋白，通过Westernblot实验分析石斛多糖对于破骨细胞形成的影响机制，分别在1,3,5天收集RNA，通过RT-PCR检测石斛多糖对于破骨细胞相关基因表达的影响；数据通过SPSS19.0软件进行统计分析，结果表示为均数±标准差((x)±s)，当P＜0.05时数据有统计学意义。
结果:M-CSF诱导的成熟骨髓单核细胞呈现扁圆形，具有伪足，利用水提醇沉法提取石斛多糖，浓度低于200μg/ml的石斛多糖对于BMMs的增殖无明显影响，当浓度达到400μg/ml时，其对BMMs会产生明显抑制作用，p＜0.05，差异就有统计学意义；Westernblot：通过不同浓度的石斛多糖作用于RANKL诱导的破骨细胞分化，检测破骨细胞活化中通路的相关蛋白，NFATc1，C-fos，P38，P-P38，P65，P-P65，以Actin作为内参，结果显示石斛多糖抑制了NFATc1，C-Fos蛋白的表达，降低了P65和P38的磷酸化水平，而且表现出了一定的剂量依赖性；RT-PCR：相较于阴性对照组，RANKL诱导组和石斛组破骨细胞相关基因均上调，但是石斛组相关基因表达显著低于纯RANKL组，且具有一定的剂量依赖，P＜0.05，差异具有统计学意义；抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示，RANKL诱导组可见体积相对较大，细胞核数目＞10的破骨细胞形成，高浓度石斛多糖组破骨细胞形成受到抑制，仅形成少数体积很小的不成熟破骨细胞。
结论:铁皮石斛多糖通过抑制破骨细胞相关基因和相关通路蛋白的合成，抑制RANKL诱导的BMMs的破骨细胞分化。