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本研究致力于新型脂肪酶/酯酶基因开发,通过对微生物基因组数据库进行筛选、分析,得到具有高催化活性的脂肪酶/酯酶。基于开发和实际应用的目的,将重组酶应用于生物催化研究。从臭豆腐卤液中分离得到可以产脂肪酶的野生菌株,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌。该脂肪酶(命名为LipBA)基因包含645个核苷酸,编码214个氨基酸,属于脂肪酶1.4家族。通过克隆重组脂肪酶质粒,将脂肪酶基因全长克隆到大肠杆菌表达系统以及枯草芽孢杆菌表达系统。克隆的重组菌都顺利表达了该外源脂肪酶基因,两者中酶活较高的是大肠杆菌表达系统。大肠表达后的蛋白经镍柱纯化得到纯酶,蛋白电泳检测显示重组蛋白大小约为22 kDa,与氨基酸序列猜测的大小相同。脂肪酶LipBA最适pH和最适温度分别为9.0和40℃,在偏碱性缓冲液pH 7.0-11.0内相对稳定。水解棕榈酸对硝基苯酯的比活为1750±153 U/mg,Km和Vmax值分别为1.04±0.06 mM和119.05±7.16μmol/(mL·min)。酶学性质尤其是有机溶剂耐受性和热稳定性方面,对于非水相催化非常有利,为脂肪酶LipBA的后续催化反应提供了研究基础。将固定化脂肪酶LipBA用于有机相合成生物柴油,最适反应条件(反应温度,反应时间,有机溶剂和不同油脂)被研究确定。与此同时,并以LipBA的冻干细胞作为全细胞催化剂,用于催化脂肪酸肉桂酯类化合物的合成,最优反应条件为:以正己烷为有机溶剂,乙酸乙烯酯为酰基供体,在40℃条件下,反应4 h后100 mM肉桂醇转化率达到93%。同时,本论文还对不同碳链长度酰基供体对底物肉桂醇的转化率进行了研究。在胜利油田附近土壤筛选到了一种可以产酯酶的原始菌株,鉴定并命名为PseudomonassynxanthaPS1。通过同源性分析和简并引物PCR,我们得到酯酶EstPS1基因全长1923个核苷酸,编码640个氨基酸。氨基酸序列分析显示该酶在N-端含有24个氨基酸的信号肽,C-端含有357-640位氨基酸的自转运结构域(Autotransporter domain)。EstPS1与Pseudomonas fluorescens A506来源的酯酶 EstA 具有最高相似性,为88%,属于酯酶EC 3.1.1.1家族。EstPS1对不同碳链长度的对硝基苯酯底物有很好的水解效果,其中对短链底物的水解活性要明显高于长链底物。酯酶EstPS1的最适温度和最适pH分别为60℃和8.0。该酶在不同温度情况下表现出极佳的热稳定性,温度60,70,80,90和100℃下的活性半衰期分别为14h,2h,31min,10min和1min。为了研究自转运结构域对该酶性质及稳定性的影响,去除自转运结构域的酯酶EstPS1△AT被构建克隆,并成功表达。自转运结构域能显著促进酯酶的胞外分泌,EstPS1△AT的酶活和胞外蛋白分泌率均显著下降。酯酶EstPS1能降解广谱范围的拟除虫菊酯类农药化合物,对不同化合物的水解活性与该农药的结构有一定关系。上述实验结果表明EstPS1具有优良的酶学性质和广泛的水解底物谱。本课题并对Geobacillus sp.基因组数据库分析,成功克隆构建数十株脂肪酶/酯酶重组菌并在大肠杆菌中实现可溶表达,将这些脂肪酶/酯酶基因与NCBI数据库上已报道的脂类水解酶的氨基酸序列比对,其同源性在60%至95%之间。以三丁酸甘油酯平板进行活性筛选,筛选到水解活性高的重组酶EstGSU753用于后续催化合成香料酯研究。