论文部分内容阅读
鸡球虫病是家禽的肠道胞内寄生原虫病。该病严重影响饲料转化效率,所以造成严重的损失。鸡球虫病目前基本通过使用化学药物进行预防治疗,然而,随着耐药性的产生和食品安全问题日益突出,有效的疫苗预防措施备受关注。本研究选取了四种巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)侵入过程相关的蛋白,进行克隆、表达并评价其免疫保护力,旨在为发现新抗原以及评价其对宿主在抗巨型艾美耳球虫感染过程中所产生的免疫保护力,提供新型疫苗候选保护性抗原。1.巨型艾美耳球虫表面蛋白基因的分子特性研究及免疫保护性研究评估本章研究成功扩增了E.maxima表面蛋白(EmSAG)的开放阅读框(ORF),序列分析后发现该基因由645对碱基所组成,编码214个氨基酸。随后,将EmSAG基因全长分别亚克隆到pET-32a(+)和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。激光共聚焦试验结果证实,EmSAG在巨型艾美耳球虫的子孢子表面分布,试验结果同时发现EmSAG也存在于裂殖子的表面。动物实验证实,rEmSAG和pVAX1-SAG都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。EmSAG疫苗可减少雏鸡的卵囊排出量,使其ACI值超过160。与PBS,pET-32a(+)和pVAX1免疫对照组的雏鸡相比,EmSAG免疫组中CD4+T和CD8+T细胞的百分含量均显著增高(P<0.05)。试验发现,与PBS,pET-32a(+)和pVAX1对照组相比,rEmSAG和pVAX1-SAG免疫组的雏鸡血清中抗EmSAG特异性抗体水平明显升高(P<0.05)。与各对照组相比,rEmSAG和pVAX1-SAG免疫组的雏鸡,血清中细胞因子IL-4、IL-17、IFN-y与TGF-β含量显著增加(P<0.05)。本章研究结果表明,EmSAG可作为诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫的保护性抗原,为研发巨型艾美耳球虫的新疫苗提供参考。2.巨型艾美耳球虫延伸因子2基因的克隆、表达及免疫保护性研究本研究成功扩增了E.maxima延伸因子2(elongation factor 2,EmEF2)完整的开放阅读框(ORF),序列分析后发现该基因由2499对碱基组成,编码832个氨基酸。随后,将EmEF2基因全长分别亚克隆到pET-32a(+)和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。动物实验证实,rEmEF2和pVAX1-EF2都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。EmEF2疫苗可减少雏鸡的卵囊排出量,使其ACI值超过160。与PBS,pET-32a(+)和pVAX1免疫对照组的雏鸡相比,EmEF2免疫组中CD4+T细胞的百分含量显著增高(P<0.05)。试验发现,与PBS、pET-32a(+)和pVAX1对照组相比,rEmEF2和pVAX1-EF2免疫组的雏鸡血清中抗EmEF2特异性抗体水平明显升高(P<0.05)。与各对照组相比,rEmEF2和pVAX1-EF2免疫组的雏鸡,血清中IFN-γ,TGF-β含量显著增加(P<0.05)。这些结果表明,EmEF可作为诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫的保护性抗原,为研发巨型艾美耳球虫的新疫苗提供备选抗原。3.巨型艾美耳球虫14-3-3基因的克隆、表达及免疫保护性研究本研究成功扩增了E.maxima14-3-3基因(Em14-3-3)完整的开放阅读框(ORF),序列分析发现该基因由861bp对碱基组成,编码286个氨基酸。随后,将Em14-3-3基因全长分别亚克隆到pET-32a(+)和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。使用激光共聚焦试验对Em14-3-3进行亚细胞定位,试验结果表明Em14-3-3在巨型艾美耳球虫的子孢子和裂殖子阶段都有表达。动物试验证实,rEm14-3-3和pVAX1-14-3-3都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。Em14-3-3疫苗可增加雏鸡的卵囊减少率,使其ACI值超过160。与PBS、pET-32a(+)和pVAX1免疫对照组相比,Em14-3-3免疫组中CD4+T细胞的百分含量显著增高(P<0.05)。与 PB S、pET-32a(+)和 pVAX 1 对照组雏鸡相比,rEm 14-3-3 和 pVAX 1-14-3-3免疫组的雏鸡,抗Em14-3-3特异性抗体水平明显升高(P<0.05)。与各对照组相比,rEm14-3-3和pVAX1-14-3-3免疫组的雏鸡,血清中IFN-γ和TGF-β水平显著增加(P<0.05)。这些结果表明,Em14-3-3可诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫,为新型巨型艾美耳球虫疫苗的研发打下基础。4.巨型艾美耳球虫棒状体蛋白基因分子特性及免疫保护性研究本研究成功扩增了E.maxima棒状蛋白(EmRON)的开放阅读框(ORF),序列分析发现该基因由2475对碱基组成,编码824个氨基酸。随后,将EmRON基因全长分别亚克隆到pET-32a(+)和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。动物实验证实,rEmRON和pVAX1-RON都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。EmRON疫苗可减少雏鸡的卵囊排出量,使其ACI值超过160。与PBS、pET-32a(+)和pVAX1免疫对照组雏鸡相比,EmRON免疫组中CD4+T细胞的的百分含量显著增高(P<0.05)。与PBS、pET-32a(+)和pVAX1对照相比,rEmRON和pVAX1-RON免疫组的雏鸡,抗EmRON特异性抗体水平明显升高(P<0.05)。与各对照组相比,rEmRON和pVAX1-RON免疫组的雏鸡,血清中细胞因子IFN-γ,TGF-β和IL-4水平显著增加(P<0.05)。这些结果表明,EmRON可诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫,为巨型艾美耳球虫疫苗的研发提供候选抗原。