大型红藻的藻红蛋白分离纯化及低凝固温度琼脂糖制备研究

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藻红蛋白是一种由多个亚基聚合并结合有色素的大分子量蛋白色素复合物,是红藻中重要的捕光色素分子。藻红蛋白因其特有的性质,在食品、化妆品、生物医药等行业具有广泛的用途。目前,由龙须菜制备藻红蛋白的工艺过程是藻体破碎粗提、盐析、多步色谱层析,这种纯化过程往往存在藻体破碎不充分、回收率低等问题。文中比较了超细破碎,液氮研磨,直接研磨对龙须菜破碎的效果,结果表明超细破碎法效果最好,藻红蛋白纯度和溶出率分别为0.35和0.44 mg/g。通过对一步盐析和两步盐析的优化,结果表明最佳的方法为两步盐析法,盐析条件为第一步20%的硫酸铵饱和盐析,然后饱和度追加到45%,此时藻红蛋白纯度为0.73,回收率为66.39%,此纯度达到食品级要求的值(>0.7)。文中对DEAE-52,Q Sepharose Fast Flow,Source15Q三种阴离子交换剂的分离纯化效果进行比较,结果表明Source15Q的分离纯化效果最好,当纯度>4.0时,回收率为66.09%。紫外可见光光谱特征表明龙须菜和缢基蜈蚣藻藻红蛋白均属于R-藻红蛋白,龙须菜藻红蛋白的荧光发射峰在578nm,缢基蜈蚣藻在587nm。龙须菜藻红蛋白的α、β和γ亚基的相对分子质量分别为18kDa、20kDa和32kDa,缢基蜈蚣藻藻红蛋白的α、β和γ亚基的相对分子质量分别为17kDa、20kDa和33kDa。  随着生物技术的快速发展,琼脂糖尤其是低电内渗琼脂糖受到了广泛的使用。目前琼脂糖已广泛应用于凝胶电泳,色谱层析,免疫学研究等方面。在琼脂搪的应用中,现代生物技术和热敏药物包埋等需要较低凝固温度的琼脂糖。本文以真江蓠,龙须菜,硬枝江蓠为研究材料,首先研究了琼脂糖的制备,工艺流程是碱处理,高温煮胶和硅藻土及活性炭过滤,最后干燥,并通过红外光谱和13C-NMR光谱研究了其化学结构。结果表明由真江蓠制备的琼脂糖质量最好,测得其电内渗(EEO)为0.116,硫酸根含量0.128%,凝胶强度1024g.cm-2,主要质量标准与Sigma公司的低电内渗琼脂糖(A9539)接近。  本文利用响应面优化法对甲基化反应制备低凝固温度琼脂糖的过程进行优化,并通过红外光谱和13C-NMR光谱对低凝固温度琼脂糖的化学结构进行研究。制备的低凝固温度琼脂糖凝固温度(l.5%,w/v)为26.7℃,融化温度(l.5%,w/v)为66.7,凝胶强度(l.5%, w/v)为269 g.cm-2。红外光谱图显示修饰后琼脂糖在1650cm-1左右处的峰分裂成1650cm-1和1566cm-1两个峰,琼脂糖甲基化修饰后的13C-NMR谱图前后对比结果表明在59.2ppm处有进一明显的-OCH3信号,这进一步证明琼脂糖修饰成功。
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