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研究背景近年来,肿瘤发病率不断上升,严重威胁人类健康。肿瘤预防,尤其是预防性肿瘤疫苗的研究,已经成为当前研究的热点。随着肿瘤干细胞理论的兴起,人们普遍认为肿瘤的生长、复发和转移与肿瘤干细胞密切相关。干细胞与普通细胞的显著差别在于其干性特征,目前已证实细胞干性的维系与OCT4、SOX2、NANOG等基因的功能密切相关。其中,Nanog蛋白是一种必要的转录因子,其主要作用是维系细胞分化能力和保持干细胞的干性。由于Nanog蛋白高表达于许多类型的肿瘤细胞,所以有学者推测肿瘤干细胞的干性也可能与Nanog的表达相关。同时,人们还发现Nanog蛋白参与肿瘤的免疫逃逸,其机制在于Nanog的高表达促使肿瘤细胞表面抗原宿主化,从而躲避免疫细胞的杀伤。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一类免疫模式识别受体,是固有免疫的重要组成部分并同时介导天然免疫和适应性免疫。其成员在一些免疫细胞和非免疫细胞中广泛表达。其中Toll样受体7(TLR7)因其激动剂是小分子咪唑奎林类似物而倍受关注。预防性肿瘤疫苗在实际应用过程中往往达不到预期的免疫预防效果,其主要原因是肿瘤抗原的弱免疫原性。TLR7小分子免疫激动剂的应用能够大大提高宿主对抗原的免疫应答水平,从而提高机体对肿瘤的免疫能力。睾丸胚胎癌(Testis embryonal carcinoma,TEC)是一种恶性程度很高的生殖肿瘤,其肿瘤干细胞显著表达干性蛋白Nanog。因此,本课题采用TLR7激动剂敏化Nanog抗原制备预防性肿瘤疫苗,并观察该疫苗的免疫激活反应和对TEC的免疫预防效果。材料与方法:采用基因工程技术构建Nanog蛋白原核表达载体,经蛋白纯化获得Nanog重组蛋白。通过化学方法将Nanog与TLR7激动剂进行偶联,制备预防性肿瘤疫苗。实验分为四组:Nanog蛋白组,TLR7激动剂组,TLR7激动剂敏化Nanog蛋白组,并以PBS为阴性对照。体外利用树突细胞(Dendritic cell,DC)与淋巴细胞共培养模型,通过酶联免疫法(ELISA)分析肿瘤疫苗诱导淋巴细胞表达IL-12,IFN-γ的变化;采用乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)法检测抗原特异性细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)的活性,判断肿瘤疫苗致敏DC细胞及其激活T细胞的能力,最终评价该肿瘤疫苗体外激活淋巴细胞的免疫原性效果。体内以制备的肿瘤疫苗免疫Balb/c小鼠后进行TEC荷瘤实验,观察肿瘤疫苗免疫对荷瘤小鼠生存时间的影响。实验结果:1、体外成功构建Nanog蛋白原核表达载体并获得纯化的Nanog蛋白;2、利用EDC/NHS偶联催化剂,成功地将Nanog蛋白与TLR7小分子激动剂偶联,测定二者偶联比为1:3.6(每个Nanog蛋白分子上偶联3-4个TLR7激动剂分子);3、偶联组与单纯使用Nanog相比,肿瘤疫苗体外能够诱导淋巴细胞IL-12,IFN-γ水平的显著提高(p<0.05)。偶联组与TLR7组相比,肿瘤疫苗体外能够诱导淋巴细胞IL-12,IFN-γ水平的显著提高(p<0.05)。4、偶联组与TLR7组相比,肿瘤疫苗体外能够诱导淋巴细胞的免疫毒性杀伤效应显著增强(p<0.05)。偶联组与单纯使用Nanog相比,肿瘤疫苗体外能够诱导淋巴细胞的免疫毒性杀伤效应无显著性差别(p>0.05)。5、偶联组与单纯使用Nanog组相比,肿瘤疫苗免疫能够显著增加荷瘤小鼠平均生存时间(疫苗组:56.5±6.83天vs.Nanog组:52.17±5.03天,p<0.05)。偶联组和TLR7组相比,肿瘤疫苗免疫能够显著增加荷瘤小鼠平均生存时间(疫苗组:56.5±6.83天vs.TLR7组:52.17±5.03天,p<0.05)。结论:Nanog蛋白本身具备一定的抗原性,TLR7偶联Nanog后,可以进一步增强Nanog的免疫原性,介导的免疫反应增强。TLR7偶联Nanog蛋白的抗肿瘤效应主要在于激发了细胞毒性T细胞的活性,可见,TLR7偶联Nanog制备的预防性肿瘤疫苗可能成为预防TEC发生的有效途径之一。