据统计2006年美国约40000例肾肿瘤的新发病例被确诊，大约13000例患者（包括成人和儿童）死于肾肿瘤。肾细胞癌是肾肿瘤中最常见的类型，占肾脏恶性肿瘤的90％以上，晚期的转移性肾癌对放疗与化疗均不敏感，一小部分患者对IL-2和IFN-α治疗有效，但药物的毒副作用十分明显。研究表明，肿瘤的发生及发展与患者体内的T淋巴细胞功能缺陷有关，进一步的研究发现，导致此缺陷的原因在于机体对成熟树突状细胞（Dendritic cell，DC）的功能下调。在体外，很多实验证实即使是晚期肿瘤患者外周血分离出的淋巴细胞对多种外界刺激仍然保持着很好的反应能力。因此，通过体外培养DC，诱导特异高效的细胞毒性T淋巴细胞（CTL），回输免疫患者，有望成为治疗肿瘤的绝佳疗法。而目前最需解决的问题是：如何在已知靶抗原的前提下，获得良好活性、足够数量的特异性CTL?DC是人体内功能最强大的抗原递呈细胞。如能将肿瘤抗原成功加载DC，可诱导抗原特异的CTL。目前，采用粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）和白介素-（Interleukin-4，IL-4）已能成功从外周血单个核细胞培养出DC。但是，如何能够有效地将抗原导入DC?又如何有效利用DC诱导T淋巴细胞产生CTL?研究表明：不同的抗原加载方式，对DC的活化效率不同，产生CTL的活性也不一致。目前抗原加载存在着多种手段，常用的策略有：抗原肽致敏DC及病毒载体携带抗原基因转染DC两种方式。采用肿瘤抗原肽致敏DC虽有抗原比较特异，可多次免疫等优点，但存在的主要问题是：这类抗原肽往往半衰期较短，因此需要多次免疫方可获得良好活性的CTL，而且转导效率低下。病素载体携带抗原肽基因转染DC，可使基因在DC体内稳定表达，从而使DC获得持续而大量的抗原肽刺激，有望解决单纯抗原肽转导存在的问题。目前转染DC常用的病毒载体有：逆转录病毒，腺病毒和慢病毒等。腺病毒载体（Ad）是常用的病毒载体之一。腺病毒载体是5型腺病毒基因重组而成的，由于其E1区的缺失，致使病毒的复制缺陷，不会引起宿主细胞的损伤或病毒扩散。展望与其它病毒载体的不同，腺病毒载体具有许多独特的优点：①宿主范围广，对人致病性低；②在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；③能有效进行增殖，滴度高；④不整合到染色体，无插入突变性；⑤能同时表达多个基因。由于腺病毒载体具有诸多优点，因此在研究中越来越多地被采用。在前期研究的基础上，设计了以下三部分研究：（1）以肾肿瘤相关抗原G250蛋白冲击DC诱导特异的CTL，研究其对肾癌细胞株的杀伤情况。（2）以Ad为载体，将G250基因转染DC诱导CTL，研究其对肾癌细胞株的杀伤情况，并与G250蛋白诱导组作比较分析。（3）转染Ad／G250的人树突状细胞诱导CTL抑制人肾癌细胞系786—0裸鼠移植瘤发生与生长。通过以上三部分研究，探讨以Ad为载体，将肾癌抗原基因转染DC并诱导CTL，用于治疗肾癌的可行性，在此基础之上，优化制备工艺，为临床试用于抗原明确的肿瘤治疗奠定实验室基础。第一部分G250蛋白致敏的DC瘤苗体外诱导特异性抗肾癌免疫1研究方法：1．1人外周血树突状细胞的分离培养及致敏取健康者外周血50ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液（1.077 Ficoll）分离获得单个核细胞（PBMC），用AIM-V培养基制成细胞悬液，加入6孔培养板（1ml／L）中，在37℃，5％CO₂条件下培养4～6h，收集悬浮细胞（冻存备用）。在培养板中加入AIM-V+GM-CSF（终浓度为800U／ml），每孔3ml，隔日半量换液，加入IL-4（终1000U／ml），于第5d将DC分为2组，一组加入G250蛋白（浓度为750ug／L），每孔100ul，另一组加PBS，两组同时加入TNF-α（终200U／ml），37℃，5％CO₂继续培养3d。1．2 DC表面标志的表达检测将培养第8d的两组DC收集，计数。取两组DC，5×10⁵／组，FITC-CD1a、PE=CD83、FITC-CD40、FITC-CD80、PE-CD86、PE-HLA-DR两两组合放入一管中标记DC，细胞用PBS洗涤2次，然后加入单抗10ul，4℃冰箱中避光反应30min，加入PBS 0.5ml，震荡悬浮细胞后上流式细胞仪分析。1．3混合淋巴细胞反应的检测取培养第8d的两组DC（一组为DC-G250；一组为DC-N）行混合淋巴细胞反应实验。将DC用30ug／ml的丝裂霉素，37℃作用30min，用PBS洗3次。冻存的自体T淋巴细胞用含IL-2（100U／L）和10％的人AB血清的RPMI-1640稀释成1×10⁶／ml，加入96孔培养板（100ul／孔）。按1：5、1：10、1：20效靶比分别加入上述两组DC，同时设对照组（加入RPMI-1640培养液），每组3个复孔，37℃，5％CO₂培养箱中孵育5d；然后加入5mg／ml的MTT 20ul／孔继续培养4h，加入二甲基亚砜（DMSO）100ul／孔。在酶标仪上测570nm波上的OD值。1．4细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性试验取培养第8d的两组DC：一组为G250蛋白致敏组（DC-G250），另一组为未致敏组（DC-N）。两组DC分加与自体淋巴细胞按1：20比例混合，以含人IL-2（终10U／ml）、GM-CSF（终800U／ml）、IL-4（终1000U／ml）、IL-7（终20ng／ml）的RPMI-1640培养液培养，5d后即获得两组CTL。收集共培养5d的两组CTL（第一组为T+DC-G250，第二组为T+DC-N）作为效应细胞，取两组的部分T（5×10⁶／组）与FITC、PE、CY标记的单抗染色，流式细胞仪行细胞表型分析；分别以786-0（人肾透明细胞癌细胞系）和A549（肺癌细胞系）为阳性和阴性靶细胞，加入效应细胞，组内设定不同的效靶比观察孔，效靶比为5：1、10：1、20：1、40：1；每种效靶比设3个复孔，继续在37℃，5％CO₂培养箱中孵育44h，然后加入5mg／ml的MTT 20ul／孔，混匀，继续培养4h，每孔加入二甲基亚砜100ul，在酶标仪上测570hm处OD值。通过所测OD值，以及单纯效应细胞和单纯靶细胞为阴性对照所测OD值，利用公式算得CTL的杀伤活性。CTL杀伤活性=靶细胞对照组OD值-（实验组OD值-效应细胞对照组OD值）／靶细胞对照组OD值。1．5统计学处理采用SPSS13.0软件进行分析，统计方法采用析因设计资料方差分析，LSD法进行多重比较，数据以均数±标准差表示，P≤0.05被认为具有统计学意义。2研究结果（1）．G250蛋白致敏组与未致敏（对照）组均高表达CD80、CD83、CD86、CD40、HLA-DR，较低表达CD1a。（2）．两组DC均能刺激T淋巴细胞的增殖，DC-G250组和DC-N组之间差异有统计学意义（F=83.545，P=0.000）；DC-G250组刺激T淋巴细胞增殖能力强于DC-N组；不同浓度效靶比之间有显著性差异，效靶比1：5时刺激增殖能力最强。（3）．DC-G250组和DC-N组所诱导的CTL表面标志CD3+和CD8+／CD3+差异有统计学意义（t=9.589 P=0.01；t=11.806 P=0.000），DC-G250组高于DC-N组。（4）．DC-G250组所诱导的CTL对786-0杀伤率高于DC-N组所诱导的CTL，两组间差异有显著性意义（F=29.483，P=0.000）；两组效应细胞对A549的杀伤率无显著性差异。3研究结论肾癌相关抗原6250蛋白致敏的DC瘤苗体外可有效的诱导出具有良好抗肿瘤活性的CTL，说明了以G250蛋白冲击DC所获瘤苗具有较好的可行性和临床应用前景。为进一步以腺病毒为载体的G250基因转染DC诱导CTL治疗肾癌的研究打下了基础。第二部分Ad／G250转染Dc诱导CTL治疗肾癌的研究1研究方法：1．1 Ad／G250转染DC并诱导CTL取健康人外周血，采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞（DC前体细胞），培养于6孔板，贴壁4～6h，轻轻洗去悬浮细胞。将贴壁细胞分为三组：基因转染组、蛋白致敏组及对照组。基因转染组感染携带G250基因的重组腺病毒Ad／G250，感染5h后更换为新鲜AIM-V培养基和GM-CSF（终浓度为800U／ml），其余两组用AIM-V培养基和GM-CSF培养。隔日半量换液，加入IL-4，终浓度为1000U／ml。第5d除加GM-CSF和IL-4外，蛋白致敏组加入G250蛋白（浓度为750ug／L），每孔100ul，对照组加PBS溶液100ul／孔，三组同时加入TNF-α（终200U／ml），37℃，5％CO₂继续培养3d。第8d，收集细胞，计数。取新分离的自体T淋巴细胞与培养所得的DC按DC：T=1：20比例混合，以AIM-V为培养基，同时加入GM-CSF（800U／ml）、IL-4（1000U／ml）、IL-2（10U／ml）及IL-7（20ng／ml），共育5d，诱导获得三组细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。1．2 Ad／G250基因表达及DC表面标志检测DC培养第8d，收集悬浮细胞（成熟DC），显微镜观察细胞形态。基因转染组DC以RT-PCR扩增G250 mRNA产物，以对照组DC做对照。流式细胞仪分析DC表面标志，表面标志选择了代表DC特征的：CD1a、CD80、CD83、CD86、HLA-DR等。1．3 DC激发活的G250抗原特异性CTL抗肿瘤活性检测激活的CTL细胞表面标志分析：在培养第13d，以带荧光标记的PE-anti-CD4、FITC-anti-CD8和PE-anti-CD56标记三组CTL，以流式细胞仪检测，从而得出三组CTL中CD8／CD4和CD8／CD56的比值。MTT法检测CTL杀伤靶细胞的抗原特异性：以G250阳性及HLA-A2阳性的人肾癌细胞系786-0做为靶细胞，所有供血者的HLA-A2均与786-0是相匹配的；取G250阴性的人肺癌细胞株A549为靶细胞做阴性对照，采用MTT法检测所诱导的CTL对各类靶细胞的杀伤效率，分析CTL杀伤的抗原特异性。2研究结果：Ad／G250高效转染DC，G250蛋白在DC内成功表达：采用RT-PCR成功在基因转染组DC中扩增出G250产物；Ad／G250转染的DC表面标志CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR与其它两组相比有显著性差异，Ad／G250组明显高表达，表明Ad／G250基因转染组可上调DC表面标志表达；Ad／G250组诱导的CTL CD8／CD4、CD8／CD56的比值高于G250蛋白刺激组及对照组；Ad／G250组诱导的CTL对G250阳性的786-0靶细胞有很好的细胞毒杀伤效应，此杀伤明显优于G250蛋白致敏组及对照组。3研究结论：以Ad为载体介导抗原基因转染DC，并诱导特异的CTL，从技术上是可行的，而且所诱导的CTL杀伤活性好于采用G250蛋白冲击致敏DC所诱导的CTL，有望成为一种肿瘤免疫治疗的理想方法。此研究方法也说明了以G250为靶点的免疫治疗可能是。肾透明细胞癌一种理想治疗模式。第三部分Ad／G250转染DC抑制786—0裸鼠移植瘤发生与生长1、研究方法1．1人外周血树突状细胞的分离培养及致敏取健康者外周血50ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液（1.077 Ficoll）分离获得单个核细胞（PBMC），用AIM-V培养基制成细胞悬液，加入6孔培养板（1ml／L）中，在37℃，5％CO2条件下培养4～6h，轻轻洗去悬浮细胞。将贴壁细胞分为两组（基因转染组、蛋白致敏组），基因转染组每孔加入Ad／G250病毒液100ul（病毒活性单位5.6×10⁹ IU／ml），感染5h后更换为新鲜AIM-V培养基和GM-CSF（终浓度为800U／ml），蛋白致敏组用AIM-V+GM-CSF培养。分别于第1d和第3d，加入GM-CSF（终浓度为800U／ml）和IL-4（终1000U／ml），隔日半量换液，第5d，两组中除加入GM-CSF和IL-4外，蛋白致敏组加入G250蛋白（浓度为750ug／L），每孔100ul，两组同时加入TNF-α（终200U／ml），37℃，5％CO₂继续培养3d。1．2诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）第8d，收集两组DC细胞，计数。以AIM-V为培养基，将两组DC与自体T细胞按DC：T=1：20的比例混合，除应用GM-CSF（终浓度800u／L）、IL-4（1000U／ml），还加入IL-2（10U／ml）及IL-7（20ng／ml），共育5d，获得两组细胞毒性T淋巴细胞（CTL）：一组为基因转染组（CTL-DC-Ad／G250）；另一组为G250蛋白冲击致敏组（CTL-DC-Pro／G250）。1．3荷瘤裸鼠模型的建立取裸鼠15只，收集对数生长期的786-0细胞，接种于裸鼠一侧肩颈部皮下，2×10⁶／只，观察肿瘤发生时间及生长情况。肿瘤大小由肿瘤最大径与最小径的乖积（mm²）来表示。1．4 DC激活的CTL预防裸鼠人肾癌细胞系786—0移植瘤发生：另外取15只裸鼠，随机分成三组，每组5只：第一组裸鼠一侧颈背部皮下注射基因转染DC诱导的CTL（2×10⁶／只）；第二组裸鼠一侧颈背部皮下注射蛋白致敏DC诱导的CTL（2×10⁶／只），第三组裸鼠颈背部皮下注射生理盐水（200ul／只）作对照。3d后取对数生长期786—0细胞（2×10⁶／只）接种于上述15只裸鼠另一侧颈背部皮下；每3d观察一次裸鼠移植瘤发生情况，直到接种后的第30d。1．5 DC激活的CTL抑制裸鼠人肾癌细胞系786—0移植瘤生长：1．3中接种786-0的裸鼠，接种后第16d，12只长出移植瘤，3只无移植瘤生长。接种后第21d，将成瘤裸鼠中肿瘤较大的两只和未成瘤的3只剔除本实验之外，入选的10只成瘤裸鼠移植瘤大小为8.6±1.2mm²。将上述10只成瘤裸鼠随机分成两组：治疗组和对照组，每组5只。在治疗组，每只裸鼠另一侧背部皮下注射Ad／G250转染DC所诱导的CTL（2×10⁶）作治疗；对照组注射生理盐水200ul。每3d观察一次移植瘤生长情况，肿瘤大小由肿瘤最大径与最小径的乖积（mm²）来表示，直至接种后45d。2结果2．1 DC激活的CTL预防肿瘤发生基因转染DC诱导的CTL和蛋白致敏DC诱导的CTL预防裸鼠移植瘤发生实验中，在接种786-0肿瘤细胞后30d内两组裸鼠中均无移植瘤发生；而对照组于接种后第15d即可见移植瘤发生，观察至30d，5只中4只有移植瘤发生。2．2 DC激活的CTL抑制移植瘤的生长以Ad／G250转染DC诱导的CTL治疗成瘤裸鼠，因经费及时间所限，至接种后的第45d结束实验。接种后的第45d对照组、治疗组移植瘤大小分别为143.37±11.6 mm²、42.55±5.62mm²。结果显示Ad／G250转染DC所诱导的CTL对已生长的786-0移植瘤确有治疗作用，与对照组相比，治疗组移植瘤生长受到明显抑制（t=2.355，P=0.047＜0.05）。3研究结论：DC诱导的抗肿瘤免疫不仅能预防裸鼠人肾癌细胞系786-0移植瘤的发生，而且能抑制移植瘤生长。提示经G250基因转染制备的DC和G250蛋白冲击致敏的DC作为一新概念上抗肿瘤疫苗可能在肾肿瘤的预防及治疗中发挥重要作用。