BTG/TOB基因家族是一个新发现的抗增殖基因家族,BTG2基因是该家族成员之一。实验室和临床研究表明,BTG2有可能是一个抑癌基因。放射治疗在肿瘤治疗中占有重要的地位,如何提高肿瘤放疗的敏感性,一直是肿瘤放射生物学所面临的重要问题。通过基因治疗进行放疗增敏是近年来研究的新方向。本课题旨在研究BTG2基因在乳腺癌细胞中的生物学功能以及相关机制,为更进一步深入开展BTG2基因的基础和临床研究提供实验基础和依据。本课题实验共分五个部分。第一部分,含BTG2基因真核表达质粒的构建和高表达BTG2的乳腺癌稳定转染细胞株的建立。首先构建含BTG2基因真核表达质粒,建立高表达BTG2基因的稳定转染乳腺癌细胞株,为后续实验奠定基础。自乳腺MCF-10A细胞中提取总RNA,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),获得BTG2基因的DNA片段,将该片段连接于pcDNA3载体,转化感受态细菌,挑取阳性克隆,提取质粒,进行酶切、鉴定和测序分析。常规培养MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞至对数生长期,应用Lipofectamine 2000将经过鉴定的pcDNA3-BTG2质粒转染进入乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231,通过G-418进行筛选,获得阳性克隆细胞,利用RT-PCR和Western blot分别从mRNA水平和蛋白水平进行BTG2表达的鉴定。结果显示:双酶切电泳图谱显示5.9 kb(pcDNA3-BTG2质粒)、500 bp(BTG2序列大小)和5.4 kb(pcDNA3序列大小)的目的条带,质粒测序结果显示与GeneBank中收录的基因序列一致,说明BTG2 DNA已经成功克隆入载体pcDNA3。RT-PCR检测结果显示,转染pcDNA3-BTG2质粒的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞BTG2 mRNA表达明显高于其母细胞和“空”质粒细胞。Western blot检测结果显示,转染pcDNA3-BTG2质粒的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞BTG2蛋白表达也明显高于其母细胞和“空”质粒细胞。第二部分,BTG2基因对乳腺癌细胞生物学特性影响的体外研究。研究BTG2基因在体外对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231生物学特性的影响,并对其机制进行初步探讨。首先应用倒置显微镜对BTG2转染前后的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞进行细胞形态观察。应用MTT法测量转染BTG2基因的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的生长曲线。通过贴壁实验来观察BTG2基因对乳腺癌细胞贴壁能力的影响。应用划痕实验检测BTG2基因对乳腺癌细胞体外迁移能力的影响。应用Boyden小室实验研究BTG2基因对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231转移能力的影响。应用流式细胞术分析转染BTG2基因的MCF-7和MDA-MB-231细胞周期变化。应用Western blot检测BTG2基因转染乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞后,细胞周期相关蛋白的变化。应用SuperArray转移相关基因芯片(OHS-028)对转染BTG2基因的MDA-MB-231/BTG2细胞和转染“空”质粒的MDA-MB-231/Neo细胞进行了对比检测,研究BTG2基因影响MDA-MB-231细胞转移的调控机制。在转染BTG2基因后,光学显微镜下观察MCF-7、MDA-MB-231细胞在形态上没有明显变化。BTG2基因抑制了乳腺癌细胞MCF-7,MDA-MB-231的增殖速率,延长了其倍增时间,同时“空”pcDNA 3质粒对两种细胞的生长没有影响。BTG2基因使MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的贴壁时间延长,贴壁率降低。BTG2基因抑制了乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的迁移和转移能力,同时“空”pcDNA3质粒对乳腺癌细胞的迁移和转移能力没有影响。BTG2基因使MCF-7细胞G1期细胞比例增高,使MDA-MB-231细胞G2期细胞比例增高。Western blot结果显示,BTG2蛋白表达增高下调了Cyclin D1和Cyclin B1蛋白。SuperArray转移相关基因芯片结果显示,在MDA-MB-231细胞,BTG2基因上调了SET、NME1、NME2和RB1基因,下调了RHOC和PLAUR基因。第三部分,BTG2对雌激素受体beta转录活性影响的研究。通过对检测BTG2与雌激素受体beta(ER-β)相互作用,以及BTG2对ER-β转录活性的调节,以了解BTG2可能通过调节ER-β信号传导的调节在乳腺癌发生和发展中的作用。采用GST-pull down和免疫共沉淀分析方法分析BTG2与ER-β蛋白之间的相互作用。采用体外双荧光报告基因分析方法测定BTG2对ER-β的转录活性的影响。结果证明BTG2蛋白可以与ER-β蛋白直接结合形成复合体,这种结合并需BTG2蛋白序列中两个NR协同抑制因子中的一个20LXXLL24结构域。BTG2能明显增加ER-β转录活性,同样也需要20LXXLL24结构域的存在,20LXXLL24结构域的灭活导致BTG2失去与BTG2与ER-β结合能力,?也失去了BTG2调节ER-β转录活性功能。第四部分,BTG2基因对乳腺癌生物学特性影响的裸鼠移植瘤模型研究。通过建立高表达BTG2基因乳腺癌细胞的裸鼠移植瘤模型,观察BTG2基因对乳腺癌细胞在裸鼠的成瘤性及远处转移能力的影响。将前述实验已建立的高表达BTG2基因的乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞稳定转染细胞株接种于BALB/c雌性裸小鼠,建立裸鼠移植瘤模型,同时分别应用两种乳腺癌细胞的母细胞和“空”质粒细胞建立裸鼠移植瘤模型作为对照组。观察移植瘤形成率,定期测量肿瘤大小,观察肿瘤生长速率;4周后处死裸鼠,观察裸鼠肝脏-和肺脏的远处转移情况。将MDA-MB-231/BTG2细胞通过尾静脉注射,建立裸鼠肺转移模型,并用MDA-MB-231/Neo细胞作为对照,观察BTG2基因对乳腺癌细胞在裸鼠形成肺转移结节能力的影响。MDA-MB-231/BTG2细胞组成功长出移植瘤为3/6,明显低于母细胞组的5/6和“空”质粒细胞组的6/6。MCF-7/BTG2细胞组成功长出移植瘤为2/6,同样明显低于母细胞组的6/6和“空”质粒细胞组的5/6。MDA-MB-231/BTG2细胞在裸鼠上形成的肿瘤体积和肿瘤大小均明显小于MDA-MB-231和MDA-MB-231/Neo细胞(p<0.01),MCF-7/BTG2细胞组也有相同情况。原位种植远处转移情况,仅MDA-MB-231组发现有1只裸鼠发生了肝脏转移,其余所有实验裸鼠均未发生远处转移。肺转移模型实验发现,MDA-MB-231/BTG2细胞组仅有3/6只裸鼠发肺转移,平均肺结节数量为10.5±2.5,而MDA-MB-231/Neo细胞组6/6只裸鼠发肺转移,平均肺结节数量也明显高于MDA-MB-231/BTG2细胞组,为13.3±3.4(p <0.05)。第五部分,BTG2基因对乳腺癌细胞辐射敏感性及机制的研究。通过对高表达BTG2基因的MDA-MB-231和MCF-7细胞进行辐射敏感性方面的实验,并对其机制进行初步探讨,研究BTG2基因在基因增敏方面应用的可能性。对高表达BTG2基因的MDA-MB-231/BTG2细胞和MCF-7/BTG2细胞应用不同剂量的x射线照射后,进行克隆形成实验,同时分别应用两种乳腺癌细胞的母细胞和“空”质粒细胞作为对照,观察BTG2基因对乳腺癌细胞放射敏感性的影响。应用流式细胞术观察BTG2基因对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7受照后细胞周期变化的影响。应用Western blot检测BTG2基因对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7受照后周期相关蛋白和辐射相关蛋白的影响。MDA-MB-231/BTG2细胞和MCF-7/BTG2细胞存活曲线均明显低于相应的母细胞和“空”质粒细胞。MCF-7/BTG2和MDA-MB-231/BTG2细胞在受照后,G0/G1期和G2/M期细胞比例均高于母细胞和“空”质粒细胞,同时,照射后的MCF-7/BTG2和MDA-MB-231/BTG2细胞均出现了明显的sub G1峰。MDA-MB-231和MCF-7两种乳腺癌细胞在受照后,均表现为BTG2蛋白表达增加,凋亡相关蛋白Bax蛋白表达增高,周期相关蛋白Cyclin D1蛋白表达降低,BTG2基因转染细胞的这种变化更为明显。在照射前,与母细胞和“空”质粒细胞相比,MDA-MB-231/BTG2细胞BTG2蛋白上调,XRCC1蛋白下调;受照射后,MDA-MB-231/BTG2细胞BTG2蛋白明显上调,同时辐射相关蛋白Ku-70蛋白、FEN-1蛋白和XRCC1蛋白均表达下调。在MCF-7三种细胞,在照射前,MCF-7/BTG2细胞即表现为BTG2蛋白表达上调,辐射相关蛋白Ku-70蛋白、FEN-1蛋白和XRCC1蛋白表达下调,在照射后,这种表现更为明显。结论:(1)成功构建pcDNA3-BTG2真核表达质粒,并且成功建立高表达BTG2基因的乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231稳定转染细胞株。(2) BTG2基因在体外可以抑制乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖能力、贴壁能力、迁移和转移能力。BTG2基因使MCF-7细胞发生更明显G1期阻滞,使MDA-MB-231细胞发生更明显G2期阻滞,机制可能与BTG2蛋白可下调Cyclin D1和Cyclin B1蛋白有关。(3) BTG2基因抑制肿瘤细胞转移可能与调控部分肿瘤转移相关基因有关,在MDA-MB-231细胞,BTG2基因上调SET、NME1、NME2和RB1基因,下调RHOC和PLAUR基因。(4) BTG2蛋白可以直接结合ER-β蛋白形成复合体,并明显地上调ER-β的转录活性。(5) BTG2基因降低了乳腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤率,同时降低了移植瘤在裸鼠体内的生长速度。BTG2基因降低了MDA-MB-231细胞的远处转移能力。(6) BTG2基因增加了乳腺癌细胞的放射敏感性,其机制可能与上调Bax基因促进受照后细胞凋亡,下调Cyclin D1蛋白使细胞发生G1期阻滞,同时下调部分辐射相关蛋白Ku-70蛋白、FEN-1蛋白和XRCC1蛋白有关。