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急性B细胞性白血病(B系ALL)是儿童血液系统最常见的恶性肿瘤，是严重威胁儿童健康的顽症，目前主要的治疗手段是抗肿瘤药物的联合化疗。尽管联合化疗的应用明显改善了儿童ALL的预后，但常规化疗在白血病细胞和正常细胞之间的选择性较差，毒副作用大，许多患儿因产生了耐药的白血病细胞而导致复发，或大剂量化疗的严重毒副作用，如严重感染、出血、重要脏器功能衰竭等而告治疗失败。自从1975年发现了单克隆抗体技术和不久后提出生物导弹设想以来，导向治疗受到许多科研工作者的关注。与化疗比较，导向治疗具有良好的选择性，它只杀伤表达靶分子的细胞，而不损伤无靶分子表达的细胞，从而大大降低药物的全身毒副作用。但是，目前大多数高亲和力的单抗属于鼠源性的，用鼠源性单抗进行临床导向治疗可以发生严重的血清病或因产生人抗鼠免疫球蛋白抗体(human anti-mouse antibody，HAMA)而消除药物的抗白血病作用等问题，限制了它们在临床上的有效应用。应用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗的基因，可以大大降低鼠单抗的免疫原性而保留其识别抗原的能力。而要研制基因工程抗体，鼠源性抗体可变区基因的克隆与测序是关键。 CD19是一种B细胞系特异的表面分化抗原，在B-ALL的阳性表达率达99.1％，在髓系细胞、红系细胞、T细胞和骨髓干细胞以及非造血器官组织上则无表达。因此，如采用抗人CD19抗体导向的生物治疗可以降低化疗的非特异性毒副作用。ZCH-4-2E8(简称2E8抗体)是本实验室研制的经国际鉴定为特异性识别CD19抗原的单抗，并正式纳入了国际CD命名系统。本课题拟对产生2E8抗体的ZCH-4-2E8杂交瘤细胞进行复苏培养和流式鉴定后，采用TA克隆体系等一系列分子生物学技晰卜大母城士公位伦大术进行鼠IgvL、vH基因克隆和测序，为进一步研制2E8基因工程抗体奠定基础。 材料与方法1.ZCH一4一2E8杂交瘤细胞复苏培养与流式鉴定:细胞复苏后常规培养于含20 %小牛血清的RPMI一1 640完全培养液，培养条件为37 OC、5%COZ、饱和 湿度。流式细胞仪鉴定其抗体亚类和对标准单抗CD19的阻滞作用。2.总RNA的抽提及mRNA纯化:T咫ZOL一步法抽提2E8细胞总RNA， PolyATtrac@mRNA分离系统纯化mRNA。紫外分光光度计测定RNA浓度。3.逆转录一聚合酶链反应(RT一PCR)扩增ZCH一4一2E8 vL和vH基因:M一MLv Rtase逆转录mRNA，37OC水浴90分钟。PCR扩增VL和VH基因。反应 体系为50林l，包含l卜g模板，lu高保真Tag酶，2林1 50mM MgC12。反应条 件是95 OC预热5分钟，进行35个循环(95“C变性50秒，58OC退火 55秒，72“C延伸60秒)，再加入普通几g酶su，72“C延伸10分钟。0.8% 琼脂糖电泳鉴定PCR产物。4.TA克隆和目的基因的测序:琼脂糖上DNA片段纯化回收，与pGEM⑧一T Easy Vector连接过夜，转化至感受态大肠杆菌DH5a，蓝白筛选，提取质粒， EcoRI酶切鉴定送测序。 结果1.2E8单抗流式细胞仪鉴定:2E8抗体亚类为IgMK，能阻滞标准单抗CO19与 Nalm一6白血病细胞的结合。2.2E8细胞RNA浓度测定:总RNAZ〔s“0.555(林g/uL)，RatioZEs=1 .811， mRNAZEs== 2.9756(抖g/mL)，RatioZos=2.107。3.RT一PCR扩增结果:重链引物29和34号在ZES细胞cDNA模板中扩增出大 小约40obp的目的条带，而同一对引物在该杂交瘤的融合对象NS一1鼠骨髓 瘤细胞cDNA模板中未扩增出相应条带。轻链引物37和44号在2E8细胞 cDNA模板中扩增出大小约400bp的目的条带，而该对引物在Ns一1细胞 cDNA模板中未扩增出相应条带。晰仁大母城士音位伦人4.TA克隆:2E8单抗重、轻链可变区基因克隆至pGEM⑧一T Easy Vector中， 采用EcoRI单酶切重组质粒DNA，并经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果 显示，单酶切可以切出大约4oobp的条带，证明重、轻链可变区基因已经克 隆到测序质粒中。5.2E8重、轻链可变区基因及其氨基酸的序列分析:vHZE:基因全长4OZbpe， 编码134个氨基酸，国际互联网检索结果显示:1~25位氨基酸为框架区1 (FRI)，26~33位氨基酸为互补决定区l(CDRI)，34~50为FRZ，51~ 58位氨基酸为CDRZ，59一96位氨基酸为FR3，97~1 11位氨基酸为CDR3。 其中第22和96位为特征性的半脱氨酸(Cys)。vLZE。基因全长348bP，编码 116个氨基酸，通过国际互联网检索结果显示:l~26位氨基酸为FRI，27~ 32位氨基酸为CDRI，33一49位氨基酸为FRZ，50~53位氨基酸为CDRZ， 54~88位氨基酸为 FR3，89~98位氨基酸为CDR3。其中第23和88位氨基 酸为特征性的Cys。 结论l、成功地完成T抗人CD19新克隆ZCH一4一2E8鼠IgM VH和VL基因的克隆与 测序，为进一步研制2E8基因工程抗体奠定了基础。2、2E8重链可变区基因片段长度为4oZbP，编码134个氨基酸。3、2E8轻链可变区基因片段长度为348bP，编码116个氨基酸。