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急性白血病是我国常见十大恶性肿瘤之一，它是造血干细胞的恶性克隆性疾病，其克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚并浸润其他器官和组织，同时使正常造血受抑制，临床表现为贫血、出血、感染及各器官浸润症状。一般可根据白血病细胞系列归属分为急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)两大类。在成年人中AML是最常见的类型。急性白血病进展迅速，如不治疗，从起病至死亡的平均时间为2-4个月。一直以来人们不断探索白血病的发病机制，从而改善白血病患者的预后。传统意义上，白血病是遗传改变的结果，包括非随机的染色体易位改变，如AML的4种最常见易位改变:t(15;17)/PML/RARα融合基因;t(8;21)/AML1-ETO融合基因;Inv(16)/(CBF)b-MYH11融合基因;11q23/MLL融合蛋白。这些细胞遗传学异常改变导致与增生、分化、凋亡相关的基因不可逆损伤和白血病相关基因的转录异常。近年来，大量研究表明表观遗传改变参与白血病的形成和发展，其中一些改变可能是早期诊断、预后评估以及预测治疗效果的标志，其中miRNA表达标签在上述作用中更有价值，可能成为白血病治疗的有效靶点。DICER是miRNA形成过程中的关键酶。
DICER是RnaseⅢ（核酸内切酶）家族成员，在人类只有DICER1一种，DICER1基因定位于14q32.2，包括28个外显子，全长52.3kb，在各种组织中广泛表达。DICE1能同时将dsRNA和miRNA前体加工成siRNA和成熟miRNA，因此是RNAi机制信号通路中的一种关键酶。已有研究发现在不同肿瘤中（如在子宫内膜腺癌、卵巢癌等癌症中DICER1表达水平下调;而在前列腺癌、直肠癌中DICER1表达水平上调）及肿瘤的不同发展阶段DICER1的表达水平不同，且与疾病的预后相关，而DICER1与血液系统肿瘤的研究鲜有报道。目前仅有Martin等报道了71例初诊AML病人中DICER1高表达，但未对其功能及调控机制进行研究。因此，本研究检测AML患者和白血病细胞系中DICER1表达水平，并通过RNAi实验检测DICER1对白血病细胞增殖、凋亡的影响。通过对DICER15旁侧区1300bp(-1200～+100)的序列进行预测发现在这段序列内含有潜在的GATA-1结合位点，我们推测DICER1在AML中的表达可能受到转录因子GATA-1的调控。GATA-1是造血系统特有的转录因子，其单独诱导多能造血干细胞向红细胞系列和巨核细胞系列分化;研究表明GATA-1在白血病细胞系及AML患者中表达，提示GATA-1可能与AML发生发展相关。通过EMSA、CHIP等实验鉴定GATA-1是DICER1启动子区重要的调控元件，为揭示DICER1在白血病发病机制中的作用提供理论依据。
材料与方法
一、实验材料
1、人白血病细胞系K562，HL-60;人胚肾细胞系HEK293
2、临床白血病患者及正常对照者的骨髓标本
3、Real-time PCR及Western印迹杂交实验相关试剂
4、细胞增殖、凋亡实验相关试剂
5、基因克隆及萤光素酶报告基因检测相关试剂
6、电泳泳动迁移实验及染色质免疫沉淀相关试剂
二、实验方法
1、Real-time PCR和western-blotting检测AML患者的骨髓标本中DICER1表达水平。
2、Real-time PCR和Western-blotting检测DICER1在白血病细胞系中的表达。
3、MTT实验与细胞凋亡实验分别检测DICER1干扰后对白血病细胞增殖与凋亡的影响。
4、Real-time PCR方法检测DICER1干扰后白血病细胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2的表达水平。
5、RT-PCR及Western-blotting检测AML患者的骨髓标本中GATA1的表达水平。
6、RT-PCR及Western-blotting检测白血病细胞系中GATA1的表达水平。
7、生物信息学软件分析DICER1启动子结构并检测其活性;
应用TRANSFAC-TESS软件，对DICER1基因5旁侧序列1300bp(-1200～+100)的序列进行预测，发现一个潜在的GATA-1结合位点(-617～-611)。构建系列截短的DICER1启动子萤光素酶报告基因载体，应用萤光素酶检测系统分析各段启动子的活性。
8、ChIP实验验证在体内条件下GATA-1与预测的DICER1启动子区GATA-1反应元件结合。
9、EMSA实验体外鉴定DICER1启动子区GATA-1反应元件。
10、Real-time PCR及Western-blotting检测GATA1干扰后DICER1 mRNA和蛋白表达水平。
11、MTT实验及细胞凋亡实验检测GATA-1干扰后对白血病细胞功能的影响。
结果：
1、急性髓细胞白血病患者的骨髓标本中DICER1表达水平显著高于正常对照组(P＜0.05);
2、白血病细胞系中DICER1的表达水平明显高于HEK293细胞(P＜0.05);
3、DICER1-shRNA转染白血病细胞K562、HL-605天后，DICER1 mRNA和蛋白表达水平显著下降，干扰效果明显(P＜0.05);
4、MTT实验结果证明:与对照组细胞相比，DICER1干扰后白血病细胞增殖力显著降低(P＜0.05);流式细胞分析表明:与正常细胞和对照组细胞比较，DICER1干扰后白血病细胞凋亡显著增加(P＜0.01);
5、Real-time PCR结果表明DICER1干扰后白血病细胞K562、HL-60中Caspase-3、Bax表达显著增加(P＜0.05)，Bcl-2表达显著下降(P＜0.05)。
6、急性髓细胞白血病患者的骨髓标本中GATA-1表达水平显著高于正常对照组(P＜0.05);
7、白血病细胞系中GATA-1的表达水平显著高于HEK293细胞(P＜0.05);
8、生物信息学软件分析预测DICER1启动子区存在潜在的GATA-1结合位点(-617～-611);萤光素酶报告基因结果表明在DICER1上游-652到-489区间内存在正调控元件;
9、ChIP实验结果证明体内条件下GATA-1与DICER1启动子区的结合
10、EMSA实验证明体外条件下GATA-1特异性结合DICER1启动子区GATA-1反应元件;
11、RT-PCR及Western-blotting证明GATA-1干扰后DICER1 mRNA和蛋白表达水平下降;
12、MTT实验结果表明GATA-1干扰后白血病细胞增殖力减弱;
13、流式细胞分析表明GATA-1干扰后白血病细胞凋亡增加。
结论：
1.DICER1在急性髓细胞白血病中高表达，并具有促进白血病细胞增殖，抑制凋亡的作用。V2.GATA-1是DICER1的转录因子，其结合位点位于DICER1启动子区-617～-611，并在转录水平调控DICER1在AML中的表达。