汞是一种广泛存在于自然界的重金属,主要以无机汞及有机汞两种形式存在。自然界中的无机汞可存在于环境中的各种介质（空气、水、土壤）中并在其中通过生物链进行循环和富集,其毒性也随之增加,人类作为食物链的终端,也成为了甲基汞的最大受害者。上世纪60年代在日本发生的水俣病以及70年代伊拉克的甲基汞毒性事件让人们开始认识到并逐渐重视甲基汞的神经毒性。甲基汞因为脂溶性高,易于通过胎盘屏障和血脑屏障,进入胎儿脑组织,使其脑细胞发生退行性变,对中枢神经系统造成不可逆的损害,影响视觉、听觉功能,引起神经行为改变,对学习记忆能力产生损害。胎儿体内的甲基汞含量总高于母体,且在母体未出现任何症状时,胎儿可能研究出现了明显症状。因此,妊娠期甲基汞中毒一直受到研究者的关注,在这方面也有大量研究。但出生后,婴儿的大脑仍然处于发育期,并可以通过母乳接触和吸收甲基汞,因此该时期的中CNS对甲基汞的神经毒性非常敏感。对出生后各时期的甲基汞神经毒性的研究也十分有意义。高剂量的甲基汞可以引起显著的神经系统疾病,但中低剂量的甲基汞暴露一般症状并不明显,而以神经行为学作为评判标准。本研究拟选择出生后不同发育期大鼠,低剂量甲基汞急性染毒,观察其学习记忆能力的改变,并探讨与其相关的分子机制。甲基汞可抑制谷氨酸重吸收减少,NMDA受体的活化可引起细胞内Ca²⁺浓度升高,ROS生成增加,对脑组织造成氧化损伤,同时NOS活化生成NO,作为逆行信号分子活化突触前膜的NMDA受体,Na⁺,Ca²⁺通道开放,影响长时程增强（LTP）的形成,从而影响学习记忆功能。NMDA受体是中枢许多突触产生去极化信号的主要基础,参与多种形式的神经元可塑性改变,可导致学习、记忆、行为障碍,在大脑的发育和成熟过程中扮演了重要角色。NMDA受体有NR 1和NR 2、NR3三种亚基,其中NR2亚单位又可分为NR2A～D四个亚型,在中枢神经系统发育的不同时期, NMDA受体亚型的表达存在选择性。NMDA受体主要有1个NR1亚基与NR2构成异构体,因此可推断NMDA受体的主要功能特性的差异源于NR2亚基的不同表达。本研究拟观察不同时期甲基汞染毒对大鼠脑组织（海马和大脑皮层）NMDA受体2亚基表达的影响,同时测定脑组织中SOD、GSH-Px还原性酶活性及NOS活性,观察脑组织中氧化损伤程度,探讨出生后甲基汞暴露对NMDA受体表达影响、氧化损伤与学习记忆之间的联系。本研究分为三个部分:第一部分甲基汞暴露对不同发育期大鼠学习记忆能力的影响目的:检测甲基汞暴露对不同发育期大鼠学习记忆能力的影响。方法:对出生后不同时期（PND7、PND14、PND28、PND60）大鼠连续7天氯化甲基（MMC）汞染毒,正常饲养至成年进行水迷宫测试,观察其学习记忆改变。分别取染毒结束后第三天及水迷宫测试后大鼠脑组织,采用原子荧光光度计检测脑组织汞含量。结果:染毒结束后,染毒组大鼠脑组织汞含量明显高于对照组（p<0.01）;不同年龄阶段甲基汞在海马组织中蓄积高于大脑皮层,但差异不具有统计学意义（p>0.05）;染毒结束正常饲养至成年,汞随着年龄增长会逐渐被分解减少,出生早期（PND7、PND14）染毒大鼠脑组织汞含量与对照组差异无统计学意义（p>0.05）,仅PND28皮层组织及PND60与对照组差异有统计学意义（p<0.01）;空间学习能力测试结果显示出生PND7、PND14染毒大鼠水迷宫测试潜伏期差明显长与对照组（p<0.01）,PND28、PND60染毒组大鼠潜伏期与对照组差异不显著（p>0.05）。结论:脱离汞环境,随时间改变脑组织汞含量会逐渐降低,但出生后第一、二周接触甲基汞对明显影响了大脑学习记忆功能,且这种损伤不具有可逆性;同样浓度的汞对PND28、PND60的大鼠学习记忆能力影响不大。第二部分甲基汞暴露对不同发育期大鼠脑组织的氧化还原酶的影响目的:甲基汞暴露对不同时期大鼠脑组织抗氧化酶SOD、GSH-Px及NOS活性改变,探讨其与学习记忆的关系。方法:取染毒结束后第三天脑组织匀浆液,使用试剂盒检测SOD、GSH-Px、NOS活性。结果:染毒组SOD活性较对照组不同程度下降,PND7、PND14海马、皮层组织染毒组与对照组差异具有统计学意义（p<0.01）,PND28海马组织染毒组与对照组差异具有统计学意义（p<0.01）;染毒组GSH-P活性较同时期对照组有不同程度下降,其中PND14、PND60海马组织与对照组差异具有统计学意义（p<0.01）,皮层组织中各时期染毒组与对照组差异具有统计学意义（p<0.01）; NOS活性染毒组较同时期对照组有不同程度增加,海马组织中PND7、PND14、PND28染毒组与对照组差异具有统计学意义（p<0.01）;皮层组织中各时期染毒组与对照组差异具有统计学意义（p<0.01）。结论:不同时期甲基汞暴露造成脑组织内还原性酶类活性下降,尤其是发育中的神经系统抗氧化损伤能力更差;NOS活性增加即脑组织内NO生成增加,可造成进一步的氧化损伤,同时可活化突触膜NMDA受体相关,造成兴奋性神经毒性,影响LTP的形成。这些改变可一定程度上解释发育中学习记忆的改变。第三部分甲基汞暴露对不同发育期大鼠脑组织NMDA受体2亚基表达的影响目的:观察甲基汞暴露对不同发育期大鼠NMDA受体2亚基mRNA水平表达的影响,探讨其与学习记忆损伤之间的关系。方法:染毒结束后第3天分别取海马、大脑皮层组织,提取总RNA,RT-PCR特异性扩增NMDA受体2A、2B、2C亚基,以β-actin为内参,半定量分析PCR产物凝胶电泳结果。结果:染毒组NR2AmRNA在海马和皮层中表达较对照组有不同程度下降,尤其PND14亚组差异具有统计学意义（p<0.05）;染毒组NR2BmRNA在海马中表达较对照组有显著下降,PND7、PND14、PND28亚组差异具有统计学意义（p<0.01）,在皮层中的表达PND7亚组差异具有统计学意义（p<0.05）;染毒组NR2CmRNA在海马和皮层较对照组表达增加,其中海马组织中PND14亚组差异具有统计学意义（p<0.01）。结论:染毒组大鼠脑组织尤其是海马组织NMDA受体2亚基mRNA表达发生了显著变化,特别是大脑发育早期,这种改变一定程度上造成了甲基汞对学习记忆能力的损害。本研究的主要结论:1)本研究对出生后不同发育期大鼠低剂量甲基急性汞暴露,发现各发育期甲基汞在脑组织中蓄积程度差异不大,PND14亚组海马组织中甲基汞浓度略高于皮层;随年龄增长,脑组织中甲基汞浓度不断下降,甚至降至与对照组无异,但仅出生早期（尤其是PND14）甲基汞暴露对大鼠的学习记忆造成损伤,且损伤一直持续到成年。2)不同发育期甲基汞暴露可使脑组织中抗氧化酶类活性降低,发育早期尤为显著,可推测甲基汞引起的氧化应激对大鼠的学习记忆的形成造成影响;同时NOS活性的增加可推断NO生成增加,一方面可以与ROS反应生成氧化毒性更大的ONNO-,另一方面也可以活化NMDA受体造成兴奋性神经毒性,并影响LTP的诱导及维持,可造成大鼠学习记忆的损伤。3)不同发育期甲基汞暴露对NMDA受体2亚基NR2A、NR2B、NR2C的正常表达和分布造成了不同程度影响,出生早期的影响尤重。这一结果一定程度上解释了发育早期甲基汞造成的氧化损伤及大鼠学习记忆能力的降低。