目的:(1)检测lnc RNA CRNDE在骨肉瘤组织及细胞系中的表达水平,分析表达水平。(2)设计并筛选出用于转染的高效靶向沉默骨肉瘤细胞系lnc RNA CRNDE的si RNA序列并以此靶向沉默lnc RNA CRNDE,研究其对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移、侵袭等肿瘤生物学行为和荷瘤裸鼠皮下移植瘤生长的影响。(3)检测启动子SP1表达增高或降低对Lnc RNA的表达的影响。(4)研究lnc RNA CRNDE在骨肉瘤细胞中的分子机制,为将来骨肉瘤靶向治疗研究提供理论基础。方法:(1)应用q RT-PCR技术检测lnc RNA CRNDE在骨肉瘤组织标本和相应瘤旁组织中的表达水平,及骨肉瘤细胞系和人正常成骨细胞系中的表达水平,并应用统计学模型处理数据。(2)应用CCK8和细胞平板克隆形成实验检测骨肉瘤细胞系增殖能力;通过流式细胞仪Annexin V-FITC/PI染色细胞凋亡检测试剂盒检测骨肉瘤细胞系的凋亡水平;通过流式细胞仪PI染色细胞周期检测试剂盒检测骨肉瘤细胞系细胞周期的变化;通过Transwell迁移实验、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测骨肉瘤细胞系的迁移和侵袭能力表现;建立荷瘤裸鼠模型,检测实验组和对照组裸鼠体重变化,绘制肿瘤体积生长曲线,检测肿瘤的重量和体积,检测两组肿瘤组织中Ki67的表达水平。(3)使用JASPAR数据库查找启动子SP1的结合位点,设计特异性SP1的小干扰RNA及SP1的过表达质粒调整SP1的表达,利用q RT-PCR检测启动子SP1对lnc RNA CRNDE的表达的影响。(4)应用Western Blot技术检测上皮间质转化相关蛋白E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,Snail,ZO-1的表达以及Wnt/β-catenin信号轴关键蛋白的表达.结果:(1)RT-PCR检测结果显示,与瘤旁组织相比较lnc RNA CRNDE在骨肉瘤组织中呈不同程度高表达。与正常成骨细胞系h FOB 1.19比较,lnc RNA CRNDE在骨肉瘤细胞系MNNG/HOS、MG63、U2OS、Sa OS-2中呈不同程度高表达。(2)CCK8和克隆形成实验示沉默lnc RNA CRNDE表达可明显抑制骨肉瘤细胞增殖能力,且抑制效果随时间增加逐渐增强;流式细胞仪Annexin V-FITC/PI染色结果示沉默lnc RNA CRNDE的表达促进细胞凋亡;流式细胞仪PI染色结果示沉默lnc RNA CRNDE表达后骨肉瘤细胞阻滞在G0/G1期且S期细胞受抑制。Transwell细胞迁移实验,细胞划痕和Transwell细胞侵袭实验提示沉默lnc RNA CRNDE表达可以抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力。lnc RNA CRNDE沉默组MNNG/HOS荷瘤裸鼠皮下移植瘤肿瘤重量明显降低,肿瘤体积生长明显受抑制,HE染色显示肿瘤细胞密度、体积、细胞核分裂程度减低,免疫组化染色示肿瘤组织中Ki67表达水平明显下降。(3)特异性小干扰RNA降低SP1的表达后,Lnc RNA CRNDE表达同时相应的降低;SP1的过表达质粒在表达增高的同时,能够提高SP1的表达,表明SP1能够调控Lnc CRNDE的表达。(4)Lnc RNA CRNDE沉默组与对照组相比:EMT相关蛋白E-cadherin,ZO-1表达上调,N-cadherin,Snail和Vimentin表达下调,敲低Lnc RNA后降低糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)磷酸化,促进了β-catenin的分解,核质分离蛋白检测,β-catenin入核的明显减少。从而降低了β-catenin下游蛋白的表达,抑制骨肉瘤的细胞的生长。结论:(1)与瘤旁组织及人成骨细胞系相比较,lnc RNA CRNDE在骨肉瘤组织及细胞系中呈高表达,提示其可能在骨肉瘤肿瘤生物学行为和发生发展过程中发挥重要调控作用。(2)沉默lnc RNA CRNDE后,骨肉瘤细胞系增殖能力受抑制,细胞凋亡增多,细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞迁移和侵袭能力下降。靶向沉默lnc RNA CRNDE后,骨肉瘤荷瘤裸鼠皮下移植瘤体内生长明显受抑制。(3)敲低CRNDE降低间充质特性蛋白N-cadherin,Vimentin和Snail的表达,并且增加上皮标记物E-cadherin,ZO-1的表达。机制研究表明CRNDE促进糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)磷酸化从而激活Wnt/β-catenin通路。CRNDE可能成为骨肉瘤新的生物标志物和治疗靶点。