论文部分内容阅读
嗜热杜邦菌（Thermomyces dupontii）可以产生强杀线虫活性的大环内酯Thermolides。前期通过基因敲除确定了PKS12是合成Thermolides的关键基因,但该簇上的6个生物合成基因是否参与Thermolides的合成尚不清楚,为了探究Thermolides生物合成基因簇上6个生物合成基因（Glycosyltransferase（GT）,Glycosylhydrolase（GH）,Acetyltransferase（AT）,Nonribosomal peptide synthetase（NRPS4）,Short chain dehrdrogenase（SDR）,Monooxygenase（MO））以及嗜热杜邦菌中另外6个非核糖体肽合成酶（NRPS1,NRPS2,NRPS3,NRPS5,NRPS6,NRPS7）基因生物学功能,基于前期本实验室在嗜热杜邦菌中开发的CRISPR/Cas9基因编辑技术,对以上这些基因构建基因功能缺失的10株突变菌株（ΔGT,ΔGH,ΔAT,ΔNRPS4,ΔSDR,ΔMO,ΔNRPS3,ΔNRPS5,ΔNRPS6,ΔNRPS7）和2株AT基因过表达突变菌株（OE-AT1和OE-AT3）。由于NRPS1和NRPS2的Protospacer位点选择不合适未获得功能缺失的突变菌株。通过突变菌株与野生菌株的代谢、表型、抗逆性和转录水平差异分析初步对这些生物合成基因的生物学功能及意义进行探究。主要结果与创新如下:1、代谢产物差异分析:与野生型菌株（WT）代谢产物比较,ΔGT突变菌株能检测到Thermolides A-E,表明GT不参与该化合物合成;ΔGH突变菌株中Thermolides A-E化合物延迟合成,且在发酵第5-6天该化合物含量比WT高12倍;ΔAT突变菌株中没有检测到带酰基的Thermolides A-C,不带酰基的Thermolides D-E含量在YGP发酵液中分别增加7和18倍,证实了AT基因负责Thermolides的乙酰化修饰;为了提高杀线虫活性较高的带乙酰基Thermolides A-B含量,对AT基因进行过表达,在过表达OE-AT菌株中检测Thermolides A-B比WT提高了70倍,Thermolides A-E总含量提高了556多倍;ΔNRPS4突变菌株中未检查到Thermolides化合物,表明NRPS4参与Thermolides合成;ΔSDR突变菌株中没有检测到Thermolides,以及可能的中间体C-6脱氢的Thermolides,C-6,8脱氢的Thermolides,C-6,8,侧链上羟基脱氢的Thermolides和Thermolides开环后的衍生物,表明原宿主中SDR基因不仅只负责Thermolides中C6位酮基还原为羟基,还参与Thermolides骨架的形成,并且至少参与三个以上的羟基还原甚至大环骨架环化过程;ΔNRPS3突变菌株代谢分析发现缺失一个特征峰,通过一级二级质谱以及吸光度推测NRPS3编码Trp、Met、Cys三个氨基酸。ΔNRPS5,ΔNRPS6和ΔNRPS7突变菌株代谢产物与WT相比只有个别峰面积增加,可能这三个基因在嗜热杜邦菌中表达量较低。2、表型差异分析:与WT的表型比较分析,GH和GT参与杜邦菌的细胞壁合成、抗渗透能力、产孢及萌发;AT参与调控菌丝生长且与温度相关,还参与抗氧化能力、产孢及萌发,且乙酰化水平过高过低都不利于产孢和孢子萌发;SDR参与真菌的抗渗透能力、细胞壁合成能力、菌丝生长、产孢及萌发;NRPS3参与产孢、萌发及菌丝在45℃生长的调控;NRPS4参与抗氧化能力;NRPS5和NRPS7影响色素的形成,参与杜邦菌的抗氧化能力及产孢和萌发,且产孢和萌发与温度相关;NRPS6、参与抗氧化能力、孢子数量及萌发;Thermolides生物合成基因簇及Tal A基因簇上的突变菌株在37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下的菌落生长情况,表明这些基因参与菌丝生长调控,且受温度影响,但具体调控机制仍待进一步研究。3、转录水平差异分析:与野生型菌株相比,五个NRPS突变菌株的上下调差异基因都很少。NRPS3正调控一个锌指CCCH类的转录因子;NRPS4敲除后没有显著的上下调差异基因;NRPS5、NRPS6、NRPS7三个基因敲除后下调前20中分别有7、13和7个甲基转移酶基因都下调,表明它们三个功能一致,且NRPS5和NRPS7基因敲除后NRPS6基因表达都上调,暗示NRPS6可能是他们的补救途径。KEGG富集分析发现这五个NRPS的表达差异基因都富集在代谢途径上,GO富集程度显著性最高的是乙酸代谢过程,而富集数目最多的是碳水化合物代谢过程以及羧酸、酮酸、有机酸代谢过程。这五个NRPS基因的敲除会影响参与代谢、氧化以及转运等过程,但具体调控机制,参与的生物学及代谢过程尚不清楚,关于这些基因更深入的生物学功能待进一步挖掘研究。