中国糯玉米多样性中心及胚乳突变型基因内分子标记策略研究

来源 :四川农业大学 | 被引量 : 14次 | 上传用户:guokaiyan
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关于中国糯玉米的起源,国内外学者做了广泛研究,虽然大多数研究者都趋向认为糯玉米起源于我国西南地区,但也存在很多争议。澄清糯玉米起源与进化问题,不但在其遗传变异研究领域具有重要的理论意义,同时对我国糯玉米育种实践具有重要指导意义。玉米胚乳突变类型来自普通玉米又优于普通玉米,具有较高的遗传附加值,在育种中占有越来越重要的地位。DNA分子标记辅助选择可避免环境条件的干扰,直接对胚乳突变基因型进行选择,提高育种效率。但是,由于分子标记与目的基因之间的连锁不够紧密,遗传交换在所难免,选择效率常比预想的低。另一方面,SSR、RFLP、AFLP等作物育种中常用的分子标记大多位于基因间非表达序列,一般无法区别与其连锁基因的表达序列差异,而这种差异才是决定育种材料间目标性状差异的主要原因。因此,根据所选择的目的基因序列差异,开发基因内选择标记(或称功能标记),对单基因以及主效多基因的选择将更为有效。在人类遗传疾病分子诊断方面,此类研究已有较多报道。然而,有关植物基因内选择标记的报道却为数不多,而且有的还是操作烦琐的RFLP标记。针对上述科学问题,本研究采用SSR标记、DNA序列分析等方法,进行了相关研究,取得了以下主要研究结果:1.根据糯玉米的糯性受隐性突变基因waxy(wx)控制,wx基因位于第9染色体9.03位置,利用第9染色体SSR标记以国内普通玉米自交系18-599为对照,对23个糯玉米地方品种遗传多样性和遗传关系进行研究。在玉米第9染色体处选取22对扩增带型稳定的引物,从供试材料中检测出73个等位基因,每对引物检测等位基因2-6个,平均3.32个,平均多态信息量0.59,平均标记索引系数2.00。分析SSR标记在这些材料中的差异程度,明确不同来源糯玉米材料的类群划分和遗传关系。引物只限在第9染色体有效排除了不同染色体遗传背景对糯质相关多样性研究的干扰;多数引物集中在9.03节点处,控制了交换所造成的遗传差异。通过UPGMA聚类分析将24个材料分为五群,第一群包含两亚群:第一亚群包括H2(黑河糯)、H3(宾县糯)、H6(友谊粘)、H8(依兰县糯),第二亚群包括Y2、H13、Yl、Y3、Y4、H11(黑包公)、Y8、Y9、Y10、Y14;第二群:普通玉米对照18-599;第三群:A2、A1、W11、W4、G49、G50;第四群:H21;第五群:H4、H5。其结果与其生态区域分布、来源等信息基本相符。来自北方地区的糯玉米地方品种和来自南方的糯玉米地方品种被划分在同一大群中,又各自划分为一亚群。这与目前许多研究认为中国的糯玉米起源于南方的观点不一致。类群划分的结果暗示中国北方可能还存在糯玉米类群,这为糯玉米种质扩增改良与创新研究提供参考,也将为糯玉米起源进化的进一步研究提供有用的线索。2.对23份北方、26份南方(包含8份四路糯)、2份美国以及76份全国糯玉米展示场的糯玉米杂交种进行waxy基因的部分片段测序及特异引物分析表明:(1)四路糯与南方糯玉米材料的waxy基因序列一致性为100%,由此推测四路糯可能是南方糯玉米生态类型的祖先;(2)根据北方和南方部分糯玉米材料的W5、WB、W4扩增片段序列比对分析结果,南方和北方糯玉米可以分为两个糯玉米生态群;(3)对北方和南方部分引物扩增片段以及NCBI核酸数据库中的30个普通玉米自交系的Waxy基因序列进行比对、ClustalW排序以及构建PhylogeneticTree,从结果显示:来源于我国南方和北方的糯玉米农家品种被划分在同一群中,暗示北方和南方的糯玉米类群可能具有相同的来源。一些研究者从糯质玉米的形态学、生理生化学、遗传学以及起源等方面进行研究认为:四路糯糯质玉米具有一系列玉米原始性状,如籽粒小、半有稃、果穗小、行数少、多果穗、多分蘖等;它以过氧化物同工酶的第5带为其标记酶带,而来源于美国的马齿(糯质马齿)玉米则以第4带为标记酶带,两带受控于一对共显性等位基因,均为绿色组织所特有。公认四路糯是中国糯玉米的祖先。3.根据颗粒凝结型淀粉合成酶基因的外显子序列,设计4对首尾交叠的特异PCR引物,分段扩增19个糯玉米自交系和2个普通玉米自交系颗粒凝结型淀粉合成酶基因的编码序列及少量侧翼序列。结果发现,不同糯玉米自交系wx基因的突变位点不同,以5’端的插入突变居多,而编码序列中部的突变较少。根据颗粒凝结型淀粉合成酶基因(Wx)与其隐性突变等位基因(wx)之间的序列差异设计特异性引物,对幼苗叶片总DNA样品进行PCR扩增。从普通玉米与糯玉米杂交F2代分离群体的130个单株中,鉴定出97个阳性单株和33个阴性单株。不仅x2测验符合3:1的分离比率,而且用2%I2/KI溶液染色鉴定表明,阳性单株的籽粒全部表现为非糯性,阴性单株的籽粒全部表现为糯性。4.以玉米O2基因为模板序列,选取O2基因变异较大的区域,使用Dnastar软件设计了3对引物,对四份高赖氨酸材料O2基因部分区域进行扩增。测序结果表明,o2位点隐性等位基因在结构上与野生型等位基因的差异主要表现为核苷酸的替换、缺失和插入,而且差异位点较多,在02基因1436位点的片段差异达到了25个碱基。根据上述实验所揭示的1475位点显性基因O2与其隐性突变等位基因o2的序列差异,设计与隐性o2基因DNA配对而不与O2基因DNA配对的特异引物,进行特异PCR扩增,可以作为隐性基因o2的基因内分子标记,通过特异PCR扩增,在O2o2和o2o2基因型中鉴定o2基因的存在。这在高赖氨酸玉米分子标记辅助育种方面具有重要意义。
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