禽流感病毒（AIV）属于甲型流感病毒。流感病毒属于RNA病毒的正黏病毒科,分甲、乙、丙3个型。在流感病毒当中,甲型流感病毒常见于禽类,一些甲型流感也有可能感染猪、马、海豹和鲸等多种哺乳动物及人类。在感染AIV之后,有的家禽不会表现出临床症状,但是有的家禽则表现为产蛋下降和呼吸道疾病,甚至有可能引发全身性疾病,有很高的死亡率,甚至会达到100%。因此,根据该病毒的致病性的高低将禽流感分为低致病性禽流感（Low pathogenic avian influenza,LPAI）和高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza,HPAI）。H9N2亚型禽流感病毒作为全世界流行最广泛的低致病性禽流感病毒之一,其对家禽生产和人类健康的影响日趋严重,逐渐成为流感病毒监测的焦点之一。然而禽流感病毒的侵入宿主细胞及其复制过程的功能机制还有待于深入探究。本论文中通过使用病毒孵育试验,质谱测序等方法筛选出Hela细胞蛋白与病毒互作的热休克蛋白（HSP70）,并通过在Hela细胞中过表达、干扰HSP70蛋白,使用抑制性抗体阻断等实验,证明HSP70蛋白与AIV入侵细胞密切相关。并且构建了三个HSP70截短体,进一步研究HSP70蛋白对H9N2亚型禽流感入侵机体时发挥重要作用的功能区域,同时成功构建了 pET28a-M2原核表达载体,并以该蛋白和纯化后的病毒为免疫原,成功制备了抗H9N2亚型禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体,为进一步研究M2蛋白与HSP70蛋白在H9N2亚型AIV复制过程的互作功能研究提供了良好的基础,为进一步开发抗甲型流感病毒药物及研究H9N2亚型禽流感病毒致病机制及诊断技术等,奠定了良好的基础。1.H9N2亚型禽流感病毒互作蛋白的筛选与鉴定H9N2亚型禽流感病毒已成为临床上普遍存在一种甲型流感病毒,不仅给养殖业造成了惨重的经济损失,而且造成了严重的公共卫生安全隐患。但H9N2亚型禽流感病毒侵入宿主细胞的分子机制还有待于进一步探索。为了研究H9N2亚型禽流感病毒入侵宿主细胞的关键靶蛋白,本研究以Hela细胞和A549细胞为细胞模型,使用超声破碎的方法,提取细胞的全蛋白,PAGE电泳后,采用病毒孵育及酶标二抗检测与病毒结合的特异蛋白条带结果证实,两种细胞孵育的蛋白条带基本相同,大小约70kd的蛋白条带。将蛋白条带切胶回收,测序分析发现与H9N2亚型禽流感病毒产生相互作用的细胞蛋白是HSP70。过表达结果证实,随着HSP70蛋白在细胞内过表达量,NP蛋白也随HSP70蛋白的增多而增多;在HSP70重组质粒转染量为1.5μg/ml时,HSP70的mRNA增殖量最大,病毒的mRNA的量也是最大的。而3μLsiRNA干扰后,HSP70蛋白的表达量明显减少,而NP蛋白略有升高,且病毒HA基因mRNA水平也略高于对照组。此外,采用HSP70抗体封闭宿主细胞后,HSP70蛋白的表达量明显减少,病毒NP蛋白表达量也减少,同时病毒HA基因的mRNA水平也明显减少。结果证明HSP70蛋白很可能作为禽流感病毒侵入宿主细胞的一种受体蛋白,协助病毒侵入细胞并参与病毒复制过程。该研究为进一步研究禽流感病毒的致病机制及靶向药物的筛选和研究奠定很好的基础。2.HSP70蛋白参与H9N2亚型AIV复制的主要功能区域探索HSP70是热休克蛋白家族中组重要的一员,在甲型流感病毒的复制的过程中有着稳定病毒蛋白、协助病毒入核、激活病毒复制活性的作用。为深入探究HSP70协助禽流感病毒侵入Hela细胞及病毒复制的功能区域,本研究分析了 HSP70蛋白的结构和生物学功能,扩增了三个HSP70基因的截断片段,即HSP70-1（24-198aa,525bp）,HSP70-2（216-374aa,477bp）和 HSP70-3（494-608aa,441bp）,并成功构建了EGFP-HSP-1,pEGFP-HSP70-2和pEGFP-HSP70-3的三个真核表达载体。将三个真核重组质粒转染Hela细胞,然后用MOI为1的H9N2亚型AIV孵育细胞,使用qPCR、Western blot及激光共聚焦显微镜观察等手段,比较分析HSP70蛋白的三个功能区域对H9N2亚型AIV的影响。结果显示,pEGFP-HSP70-1转染的细胞中病毒NP蛋白表达略有下降;pEGFP-HSP70-2转染的细胞中,病毒NP蛋白表达无明显变化;而pEGFP-HSP70-3转染的细胞中,病毒NP蛋白表达略有上升,且病毒HA基因的mRNA水平明显上升。共聚焦显微镜观察到,pEGFP-HSP70-3转染的细胞中,病毒NP蛋白主要在细胞质中,而HSP70-3重组表达蛋白则主要位于细胞核内。由此推测HSP70-3可能是HSP70蛋白参与H9N2亚型AIV的侵入及复制过程的主要功能区域。该研究为进一步研究HSP70蛋白生物学功能的研究提供思路和方法,并为开发抗禽流感病的的特异性靶向药物奠定基础。3.H9N2亚型禽流感病毒M2蛋白的表达及单克隆抗体的研制本研究已证实HSP70参与H9N2亚型AIV侵入宿主细胞及病毒复制过程。禽流感病毒的M2蛋白是一种多功能的蛋白,在病毒的侵入、组装及释放方面起到重要的作用。那么,在H9N2亚型AIV的复制过程,M2蛋白与HSP70蛋白如何相互作用,值得深入研究。为了研究M2蛋白的基因功能,本研究中提取H9N2亚型禽流感病毒的总RNAs,采用PCR技术成功扩增了 H9N2分离株LY1毒株的M2的基因。借助基因工程技术,将M2基因片段成功连接到pET28a原核表达载体中,构建了 pET28a-M2重组质粒,并诱导表达出相应的融合蛋白。免疫印迹技术结果证实纯化融合蛋白具有免疫原性。为了制备M2蛋白的单克隆抗体,分别使用纯化后的病毒及纯化后的M2蛋白作为免疫原免疫六周龄的雌性Balb/c小鼠,取小鼠脾脏与SP2/0细胞融合,以纯化的M2蛋白作为ELISA抗原进行检测及亚克隆。结果获得了 5株稳定分泌抗M2抗体的杂交瘤细胞株。间接ELISA及间接免疫荧光证实了这些单克隆抗体的特性。该结果为进一步研究M2蛋白与HSP70蛋白在H9N2亚型AIV复制过程的互作功能研究提供了良好的基础,为进一步开发抗甲型流感病毒药物及研究禽流感H9N2亚型致病机制及诊断技术等,奠定了良好的基础。